Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
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Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche du yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Les auteurs remercient les personnes qui ont généreusement donné leur corps au Yonsei University College of Medicine. Nous sommes reconnaissants à Jun Ho Kim et Jong Ho Bang pour leur soutien technique (membres du personnel du Centre d'éducation en anatomie chirurgicale du Yonsei University College of Medicine). Nous sommes également reconnaissants à Genoss Co., Ltd. pour le système de balayage microCT de haute qualité utilisé dans cette recherche.

Tous les cadavres utilisés dans cette étude ont été légalement donnés au Centre d'éducation en anatomie chirurgicale du Yonsei University College of Medicine.
1. Obtenir des échantillons
<ol><li>Dessiner une ligne d'incision sur le cadavre avec un crayon de couleur pour indiquer la zone de coupe pour la récolte de l'échantillon. Vérifiez que la ligne d'incision tracée s'étend médialement à un canthus médial, latéralement à un canthus latéral, supérieure à une bordure sup...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Nous avons mis en œuvre le microCT avec la préparation de PTA dans l'examen des tissus mous humains. En bref, les spécimens sont récoltés et fixés en formaline pendant quelques jours, suivis d'une déshydratation dans des solutions d'éthanol en série. Placer l'échantillon dans la solution PTA directement après fixation formaline peut entraîner une certaine fissuration des tissus en raison de la déshydratation rapide. Par conséquent, la déshydratation en série est nécessaire avant la coloration PTA. Ensuit...

La dissection manuelle et l'observation histologique sont généralement utilisées pour examiner les tissus humains, tels que les muscles et les tissus conjonctifs. Cependant, la dissection manuelle peut facilement endommager les structures délicates, et l'observation histologique fournit des informations limitées sur les surfaces transversales plates1,2. Par conséquent, des méthodes améliorées sont nécessaires pour examiner les tissus plus précisément et efficacement.
La tomographie calculée conventionnelle (CT) est généralement utilisée dans la pratique clinique, mais elle n'a pas la capacité de distinguer les petites structures2,3. Micro X-ray CT (microCT) est un outil efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles (3D) de petites structures à partir de spécimens, sans les détruire. Cependant, le microCT a des applications limitées parce que seuls les tissus denses peuvent être visualisés clairement ; il ne peut pas être utilisé pour différencier les tissus mous. Pour surmonter cette limitation, des agents de coloration peuvent être utilisés. Les agents d'amélioration du contraste, comme l'acide phosphotungstic (PTA), l'acide phosphomolybdique, et l'iode de Lugol, améliorent le taux de contraste de tissu mou pendant le balayage4,5. Plusieurs études comparant ces agents suggèrent que PTA démontre de bonnes performances et est facile à gérer6,7,8.
Le ligament de retenue orbicularis (ORL) est une structure délicate autour de l'orbite, qui peut être facilement endommagée lors de l'observation conventionnelle9. Nous avons examiné et récupéré avec succès l'information 3D sur cette structure utilisant le microCT avec PTA comme agent de contraste. Cette méthode peut être appliquée à des études sur d'autres tissus humains, tels que le cœur et le foie, avec des modifications appropriées10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

La dissection manuelle et l'observation histologique sont des méthodes courantes utilisées pour étudier les tissus humains. Cependant, la dissection manuelle peut endommager les structures délicates, tandis que le traitement et l'observation histologique fournissent l'information limitée par l'imagerie transversale. La micro-radiographie de la tomographie calculée (microCT) est un outil efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles sans endommager les spécimens. Cependant, il montre une efficacité limitée dans la différencié des parties des tissus mous. L'utilisation d'agents améliorant le contraste, comme l'acide phosphotungstic (PTA), peut résoudre ce problème en améliorant le contraste des tissus mous. Nous avons mis en œuvre le microCT avec PTA pour étudier le ligament de retenue d'orbicularis humain (ORL), qui est une structure délicate dans la zone orbitale. Dans cette méthode, les spécimens récoltés sont fixés en formaline, déshydratés dans des solutions d'éthanol en série, et tachés d'une solution PTA. Après coloration, balayage de microCT, reconstruction 3D, et analyse sont exécutés. La peau, les ligaments et les muscles peuvent être clairement visualisés à l'aide de cette méthode. La taille du spécimen et la durée de la coloration sont des caractéristiques essentielles de la méthode. L'épaisseur appropriée du spécimen était d'environ 5 à 7 mm, au-dessus de laquelle le processus a été ralenti, et la durée optimale était de 5 à 7 jours, en dessous duquel un trou vide dans la zone centrale s'est produit occasionnellement. Pour maintenir l'emplacement et la direction des petits morceaux pendant la coupe, il est recommandé de coudre sur la même région de chaque pièce. En outre, des analyses préliminaires de la structure anatomique sont nécessaires pour identifier correctement chaque pièce. Le parafilm peut être utilisé pour prévenir le séchage, mais il faut prendre soin d'éviter la distorsion des spécimens. Notre observation multidirectionnelle a montré que l'ORL est composé d'un maillage multicouches de plaques continues, plutôt que de fibres fil-like, comme rapporté précédemment. Ces résultats suggèrent que le balayage de microCT avec PTA soit utile pour examiner des compartiments spécifiques dans les structures complexes du tissu humain. Il peut être utile dans les analyses des tissus cancéreux, des tissus nerveux, et divers organes, comme le cœur et le foie.

La reconstruction détaillée de l'ORL a été réalisée par microCT avec préparation PTA (Figure 4). La structure fibromusculaire ligamentaire s'étendant obliquement entre le derme et le périosteum a été distinctement observée (figure 4A). Dans la vue coronale (Figure 4B), la quantité et la complexité des fibres ont augmenté latéralement. Dans la vue horizontale (figure 4C), un maillage éla...

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Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

La tomographie calculée par rayons X micro est efficace pour obtenir des informations tridimensionnelles à partir de spécimens humains intacts, mais a un succès limité dans l'observation des tissus mous. L'utilisation de l'agent de contraste d'acide phosphotungstic peut résoudre ce problème. Nous avons mis en œuvre cet agent de contraste pour examiner les tissus fibromusculaires fragiles humains (le ligament de maintien de l'orbicularis).

Utilisation de la tomographie calculée par rayons X micro avec préparation d'acide phosphotungstic pour visualiser le tissu fibromusculaire humain

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Nous mettons en œuvre microCT avec de l’acide phosphotungstic pour améliorer le contraste des tissus mous dans l’enquête non invasive de l’orbicularis humain soutènement ligament, une structure délicate dans la zone de l’orbite. Ce protocole a été optimisé pour aider les chercheurs dans l’investigation non invasive des tissus mous humains et est simple à exécuter avec un montant raisonnable de dépenses. Pour obtenir les échantillons, utilisez d’abord un crayon de couleur pour indiquer la zone de coupe sur la peau pour la récolte de l’échantillon.Confirmez que la ligne marquée s’étend médiocrement à un campus médial, latéralement à un campus latéral, supérieure à une bordure supérieure de la paupière inférieure, et inférieurement à un centimètre au-dessous de la ligne de la jante orbitale. Ensuite, utilisez une lame pour couper les tissus faciaux le long de la ligne marquée, en s’assurant que la coupe est suffisamment profonde pour que la pointe de la lame touche l’os. L’échantillon récolté doit inclure la peau, les tissus sous-cutanés, les muscles, les graisses et le périoste.Lors de la collecte, fixez immédiatement l’échantillon à 10 % de formaline pendant cinq à sept jours à température ambiante. À la fin de la période de fixation, couper l’échantillon en trois morceaux de cinq à sept millimètres d’épaisseur. Utilisez une aiguille et un fil noir pour coudre le côté superolateral de chaque échantillon de sorte que la direction de l’échantillon puisse être déterminée à des moments ultérieurs.Déshydratez l’échantillon dans une série ascendante de concentration d’éthanol pour une journée par concentration, laissant les échantillons dans la solution d’éthanol à 70 % jusqu’à ce qu’ils soient contaminés. Une semaine avant la tonte du microordinateur, ajouter 2,1 grammes de PTA à 210 millilitres de 70% d’éthanol et placer la solution sur un shaker à 55 à 60 rotations par minute. Préparer trois contenants en plastique de 70 millilitres pour chaque pièce tranchée.Lorsque le colorant s’est dissous dans la solution d’alcool, remplissez les contenants de la solution. Placez un spécimen dans chaque contenant de 1 % de PTA et secouez les échantillons à 55 à 60 rotations par minute pendant cinq à sept jours. Lorsque la coloration est terminée, conserver les échantillons dans de l’éthanol frais à 70 % pendant une semaine pour se préparer à la numérisation.Pour la numérisation microCT, envelopper les échantillons dans Parafilm pour éviter le séchage et placer un échantillon sur le plateau du scanner. Réglez la tension source du scanner à 70 kilovolts, le courant source à 114 microampes, le filtre en aluminium à 0,5 millimètres, la taille du pixel d’image à 20 micromètres carrés, les pixels à 2 240 par 2 240, l’exposition à 500 millisecondes et l’étape de rotation à 0,3 degré. Ensuite, lancez la numérisation.Lorsque la numérisation est terminée, ouvrez le logiciel de reconstruction et sélectionnez Actions et Open Dataset pour lancer les fichiers numérisés. Sélectionnez l’onglet Paramètres et réglez la réduction des artefacts de l’anneau à sept et la correction de durcissement du faisceau. Pour commencer la reconstruction, sélectionnez Démarrer.Les données finales seront stockées dans le dossier désigné. À la fin de la reconstruction, ouvrez le logiciel de resizing de fichier et sélectionnez l’ensemble de données Source pour lancer les fichiers reconstruits. Sélectionnez jpg sur l’onglet ensemble de données Destination et sélectionnez l’option de resizing 1/2 avec l’option Qualité de Pas d’interpolation Puis ajustez la barre de diapositives à 100 dans l’onglet de compression d’image et démarrez la conversion.Pour la reconstruction 3D, ouvrez le logiciel de rendu de volume 3D et sélectionnez actions et données de volume de charge. Pour ajuster la luminosité et le niveau de contraste, modifiez la fonction de transfert de forme dans l’histogramme de l’onglet Éditeur de fonction de transfert. Sélectionnez ensuite options et éclairage, et sélectionnez les icônes Ombres et Éclairage de surface pour obtenir un ton de modélisation réaliste.Cliquez et faites glisser, et cliquez à droite et faites glisser pour déplacer et faire pivoter l’image 3D pour trouver la meilleure vue, défilement pour zoomer ou sortir comme vous le souhaitez. Cliquez sur Décalage et faites glisser pour faire glisser l’endroit pour afficher les images sectionnelles. Allumez l’icône Lumière et ajustez la barre d’indication d’éclairage pour trouver le meilleur éclairage pour la visualisation, puis éteignez l’icône Lumière et fermez l’onglet Éclairage.Dans l’onglet Options, sélectionnez Afficher et couper la boîte pour masquer la case pour l’image finale. Ensuite, sélectionnez Actions et Enregistrer l’image pour stocker l’image. Cette reconstruction détaillée de l’ORL a été réalisée par microCT avec la préparation de PTA comme démontré, permettant la visualisation d’une structure fibromusculaire ligamentaire s’étendant obliquement entre le derme et le périoste.Dans la vue coronale, la quantité et la complexité des fibres augmente latéralement. Dans la vue horizontale, on observe un maillage élaboré avec une formation arborisée. Dans la vue sagittale, les épaisseurs des fibres ORL diminuent de façon inférieure.Dans l’ensemble, cette observation multidirective prouve que l’ORL est composé d’un maillage multicououche de plaques continues avec des variations dans le nombre et l’épaisseur des fibres en fonction de leur emplacement. Lorsque la durée de la coloration est insuffisante par rapport au volume d’un spécimen, l’image finale peut inclure un trou vide dans la zone centrale du spécimen. D’autres agents à côté de PTA peuvent être utilisés et différents agents ont des mérites différents ou des intérêts de caractéristiques de coloration.Par conséquent, il est utile d’optimiser la région de coloration en fonction de votre expérience.

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