Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
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Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der Fakultät des Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099) unterstützt. Die Autoren danken den Menschen, die ihre Körper sehr großzügig an das Yonsei University College of Medicine gespendet haben. Wir danken Jun Ho Kim und Jong Ho Bang für ihre technische Unterstützung (Mitarbeiter im Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine). Wir danken auch Der Genoss Co., Ltd. für das hochwertige MicroCT-Scansystem, das in dieser Forschung zum Einsatz kommen.

Alle in dieser Studie verwendeten Kadaver wurden legal an das Surgical Anatomy Education Centre am Yonsei University College of Medicine gespendet.
1. Beschaffung von Proben
<ol><li>Zeichnen Sie eine Schnittlinie auf dem Kadaver mit einem Buntstift, um die Schnittfläche für die Probenernte anzuzeigen. Prüfen Sie, ob sich die gezogene Schnittlinie medial zu einem medialen Canthus, seitlich zu einem seitlichen Canthus, überlegen zu einem oberen Rand des unteren Augenlids und unter der Lini...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Wir implementierten microCT mit PTA-Präparat bei der Untersuchung menschlicher Weichgewebe. Kurz gesagt, Proben werden geerntet und in Formalin für ein paar Tage fixiert, gefolgt von Dehydrierung in seriellen Ethanol-Lösungen. Das Platzieren der Probe in die PTA-Lösung direkt nach der Formalinfixierung kann zu einigen Geweberissen aufgrund einer schnellen Dehydrierung führen. Daher ist eine serielle Dehydrierung vor der PTA-Färbung erforderlich. Als nächstes werden die Proben mit PTA-Lösung für etwa eine Woche g...

Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung werden in der Regel verwendet, um menschliche Gewebe zu untersuchen, wie Muskeln und Bindegewebe. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen leicht beschädigen, und die histologische Beobachtung liefert nur begrenzte Informationen über flache Querschnittsflächen1,2. Daher sind verbesserte Methoden erforderlich, um Gewebe genauer und effizienter zu untersuchen.
Konventionelle Computertomographie (CT) wird in der Regel in der klinischen Praxis verwendet, aber es fehlt die Fähigkeit, kleine Strukturen zu unterscheiden2,3. Micro-Röntgen-CT (microCT) ist ein effektives Werkzeug, um dreidimensionale (3D) Informationen über kleine Strukturen von Proben zu erhalten, ohne sie zu zerstören. MicroCT hat jedoch nur begrenzte Anwendungen, da nur dichtes Gewebe klar visualisiert werden kann; es kann nicht verwendet werden, um Weichgewebe zu unterscheiden. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Färbemittel verwendet werden. Kontrastverstärkende Wirkstoffe wie Phosphotungssäure (PTA), Phosphomolybdidsäure und Lugols Jod verbessern die Weichteilkontrastrate beim Scannen4,5. Mehrere Studien, die diese Agenten vergleichen, deuten darauf hin, dass PTA eine gute Leistung zeigt und leicht zu handhaben ist6,7,8.
Das Orbicularis-Retainband (ORL) ist eine empfindliche Struktur um die Umlaufbahn, die bei konventioneller Beobachtung leicht beschädigt werden kann9. Wir haben 3D-Informationen zu dieser Struktur unter Verwendung von microCT mit PTA als Kontrastmittel untersucht und erfolgreich abgerufen. Diese Methode kann auf Studien an anderen menschlichen Geweben, wie Herz und Leber, mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

Manuelle Zerlegung und histologische Beobachtung sind gängige Methoden zur Untersuchung menschlichen Gewebes. Die manuelle Zerlegung kann jedoch empfindliche Strukturen beschädigen, während Verarbeitung und histologische Beobachtung nur begrenzte Informationen durch Querschnittsbildung liefern. Die Mikro-Röntgen-Computertomographie (microCT) ist ein wirksames Werkzeug, um dreidimensionale Informationen zu erhalten, ohne Proben zu beschädigen. Es zeigt jedoch eine begrenzte Effizienz bei der Differenzierung von Weichteilteilen. Die Verwendung von kontrastverstärkenden Wirkstoffen, wie Phosphotungstiksäure (PTA), kann dieses Problem lösen, indem der Weichteilkontrast verbessert wird. Wir implementierten microCT mit PTA, um das humane Orbicularis-Retaining-Band (ORL) zu untersuchen, das eine empfindliche Struktur im Orbitbereich ist. Bei diesem Verfahren werden geerntete Proben in Formalin fixiert, in seriellen Ethanollösungen dehydriert und mit einer PTA-Lösung gebeizt. Nach der Färbung werden MicroCT-Scans, 3D-Rekonstruktionen und Analysen durchgeführt. Haut, Bänder und Muskeln können mit dieser Methode klar visualisiert werden. Die Probengröße und die Dauer der Färbung sind wesentliche Merkmale des Verfahrens. Die geeignete Probendicke betrug etwa 5–7 mm, oberhalb derer der Prozess verlangsamt wurde, und die optimale Dauer betrug 5–7 Tage, unter denen gelegentlich ein leeres Loch im zentralen Bereich auftrat. Um die Position und Richtung der kleinen Stücke während des Schneidens zu erhalten, wird das Nähen auf der gleichen Region jedes Teils empfohlen. Darüber hinaus sind vorläufige Analysen der anatomischen Struktur erforderlich, um jedes Stück korrekt zu identifizieren. Parafilm kann verwendet werden, um das Trocknen zu verhindern, aber es sollte darauf geachtet werden, Probenverzerrungen zu vermeiden. Unsere multidirektionale Beobachtung zeigte, dass der ORL aus einem mehrschichtigen Netz aus kontinuierlichen Platten besteht und nicht aus fadenähnlichen Fasern, wie bereits berichtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass MikroCT-Scanning mit PTA nützlich ist, um bestimmte Abteilungen innerhalb komplexer Strukturen menschlichen Gewebes zu untersuchen. Es kann bei der Analyse von Krebsgeweben, Nervengeweben und verschiedenen Organen, wie Herz und Leber, hilfreich sein.

Die detaillierte Rekonstruktion des ORL wurde durch microCT mit PTA-Präparation erreicht (Abbildung 4). Die kreuzbandige fibromuskuläre Struktur, die sich schräg zwischen der Dermis und dem Periost eitel ausdehnt, wurde deutlich beobachtet (Abbildung 4A). In der koronalen Ansicht (Abbildung 4B) nahmen die Menge und Komplexität der Fasern seitlich zu. In der horizontalen Ansicht (Abbildung 4C) wurde ...

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Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Die Mikro-Röntgen-Computertomographie ist wirksam bei der Beschaffung dreidimensionaler Informationen von unbeschädigten menschlichen Proben, hat aber nur begrenzten Erfolg bei der Beobachtung von Weichgeweben. Die Verwendung von Phosphotungstiksäure Kontrastmittel kann dieses Problem lösen. Wir implementierten dieses Kontrastmittel, um menschliche empfindliche fibromuskuläre Gewebe (das Orbicularis-Rückhalteband) zu untersuchen.

Verwendung von Mikro-Röntgentomographie mit Phosphotungstic Acid Preparation zur Visualisierung von humanem fibromuskulärem Gewebe

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Wir implementieren microCT mit Phosphotungssäure, um den Weichteilkontrast in der nicht-invasiven Untersuchung des menschlichen Orbicularis-Rückhaltebandes zu verbessern, einer empfindlichen Struktur innerhalb des Orbitbereichs. Dieses Protokoll wurde optimiert, um Forscher bei der nicht-invasiven Untersuchung von menschlichen Weichteilen zu unterstützen und ist einfach mit einem angemessenen Aufwand durchzuführen. Um die Proben zu erhalten, verwenden Sie zunächst einen Buntstift, um die Schnittfläche auf der Haut für die Probenernte anzuzeigen.Bestätigen Sie, dass sich die markierte Linie medial zu einem medialen Campus erstreckt, seitlich zu einem seitlichen Campus, überlegen zu einer höheren Grenze des unteren Augenlids und schlechter zu einem Zentimeter unter der Linie vom Orbitalrand. Als nächstes verwenden Sie eine Klinge, um das Gesichtsgewebe entlang der markierten Linie zu schneiden, um sicherzustellen, dass der Schnitt tief genug ist, damit die Klingenspitze den Knochen berührt. Die geerntete Probe muss die Haut, das Unterhautgewebe, den Muskel, das Fett und das Periost enthalten.Nach der Entnahme die Probe sofort in 10% formalin für fünf bis sieben Tage bei Raumtemperatur fixieren. Am Ende der Fixierungszeit die Probe in drei fünf bis sieben Millimeter dicke Stücke schneiden. Verwenden Sie eine Nadel und ein schwarzes Gewinde, um die superolaterale Seite jeder Probe so zu nähen, dass die Richtung der Probe zu späteren Zeitpunkten bestimmt werden kann.Dehydrieren Sie die Probe in einer aufsteigenden Ethanolkonzentrationsreihe für einen Tag pro Konzentration, sodass die Proben in der 70%ethanol Lösung bleiben, bis sie färben. Eine Woche vor dem geplanten Scannen der Mikrocomputer-Tomographie 2,1 Gramm PTA auf 210 Milliliter 70% Ethanol hinzufügen und die Lösung auf einen Shaker bei 55 bis 60 Umdrehungen pro Minute legen. Bereiten Sie drei 70-Milliliter-Kunststoffbehälter für jedes geschnittene Stück vor.Wenn sich der Farbstoff in die Alkohollösung aufgelöst hat, füllen Sie die Behälter mit der Lösung. Legen Sie eine Probe in jeden Behälter mit 1%PTA und schütteln Sie die Proben fünf bis sieben Tage lang mit 55 bis 60 Umdrehungen pro Minute. Wenn die Färbung abgeschlossen ist, lagern Sie die Proben in frischem 70% Ethanol für eine Woche, um sich auf das Scannen vorzubereiten.Um das Trocknen zu verhindern, wickeln Sie die Proben in Parafilm und legen Sie eine Probe auf das Scannerfach. Stellen Sie die Quellspannung des Scanners auf 70 Kilovolt, den Quellstrom auf 114 Mikroampere, den Aluminiumfilter auf 0,5 Millimeter, die Bildpixelgröße auf 20 quadratische Mikrometer, die Pixel auf 2, 240 x 2, 240, die Belichtung von 500 Millisekunden und den Rotationsschritt auf 0,3 Grad. Starten Sie dann den Scanvorgang.Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie die Rekonstruktionssoftware, und wählen Sie Aktionen und Dataset öffnen aus, um die gescannten Dateien zu starten. Wählen Sie die Registerkarte Einstellungen aus, und legen Sie die Ringartefakte reduktion auf sieben und die Strahlhärtekorrektur fest. Um mit der Rekonstruktion zu beginnen, wählen Sie Start aus.Die endgültigen Daten werden im angegebenen Ordner gespeichert. Öffnen Sie am Ende der Rekonstruktion die Dateigrößenänderungssoftware, und wählen Sie Quelldatensatz aus, um die rekonstruierten Dateien zu starten. Wählen Sie jpg auf der Registerkarte Zieldatensatz und wählen Sie die 1/2-Größenänderungsoption mit der Option Qualität "Keine Interpolation" Dann passen Sie die Schiebeleiste auf 100 auf der Registerkarte Bildkomprimierung an und starten Sie die Konvertierung.Öffnen Sie für die 3D-Rekonstruktion die 3D-Volume-Rendering-Software, und wählen Sie Aktionen und Volumedaten laden aus. Um die Helligkeit und den Kontrastpegel anzupassen, ändern Sie die Formübertragungsfunktion im Histogramm auf der Registerkarte Übertragungsfunktion. Wählen Sie als Nächstes Optionen und Beleuchtung aus, und wählen Sie die Symbole Schatten und Flächenbeleuchtung aus, um einen realistischen Modellierungston zu erzielen.Klicken und ziehen Sie mit der rechten Maustaste und ziehen Sie, um das 3D-Bild zu verschieben und zu drehen, um die beste Ansicht zu finden, und scrollen Sie, um wie gewünscht zu vergrößern oder zu verkleinern. Klicken Sie auf Umschalttaste und Ziehen, um die Stelle zu verschieben, an der die Schnittbilder angezeigt werden. Schalten Sie das Lichtsymbol ein, und passen Sie die Anzeigeleiste an, um die beste Anzeige zu finden, schalten Sie dann das Lichtsymbol aus und schließen Sie die Registerkarte Beleuchtung.Wählen Sie auf der Registerkarte Optionen die Option Anzeigen und Zuschneiden aus, um das Feld für das endgültige Bild auszublenden. Wählen Sie dann Aktionen und Bild speichern aus, um das Bild zu speichern. Diese detaillierte Rekonstruktion des ORL wurde durch mikroCT mit PTA-Präparat erreicht, wie gezeigt, was die Visualisierung einer bandförmigen fibromuskären Struktur ermöglicht, die sich schräg zwischen der Dermis und dem Periost eitern.In der koronalen Ansicht erhöht sich die Menge und Komplexität der Fasern seitlich. In der horizontalen Ansicht wird ein ausgeklügeltes Netz mit einer arborisierten Formation beobachtet. In der sagittalen Ansicht nimmt die Dicke der ORL-Fasern schlechter ab.Insgesamt beweist diese multidirektionale Beobachtung, dass der ORL aus einem mehrschichtigen Netz aus kontinuierlichen Platten mit Variationen in Anzahl und Dicke der Fasern je nach Position besteht. Wenn die Dauer der Färbung im Vergleich zum Volumen einer Probe nicht ausreicht, kann das endgültige Bild ein leeres Loch im zentralen Bereich der Probe enthalten. Andere Agenten neben PTA können verwendet werden und verschiedene Agenten haben unterschiedliche Verdienste oder Färbung Eigenschaften Interessen.Daher ist es sinnvoll, den Färbebereich entsprechend Ihrem Experiment zu optimieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Biotechnik

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