Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
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Questo studio è stato sostenuto da una borsa di ricerca facoltà di Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Gli autori ringraziano le persone che hanno generosamente donato i loro corpi allo Yonsei University College of Medicine. Siamo grati a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang per il loro supporto tecnico (membri del personale del Centro di educazione all'anatomia chirurgica presso lo Yonsei University College of Medicine). Siamo anche grati a Geoss Co., Ltd. per il sistema di scansione microCT di alta qualità utilizzato in questa ricerca.

Tutti i cadaveri utilizzati in questo studio sono stati legalmente donati al Surgical Anatomy Education Centre dello Yonsei University College of Medicine.
1. Ottenere campioni
<ol><li>Disegnare una linea di incisione sul cadavere con una matita colorata per indicare l'area di taglio per la raccolta dei campioni. Controllare che la linea di incisione disegnata si estenda mediamente a un canto mediale, lateralmente a un canto laterale, superiore a un bordo superiore della palpebra inferiore e...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Abbiamo implementato microCT con preparazione PTA nell'esame dei tessuti molli umani. In breve, i campioni vengono raccolti e fissati in formalina per alcuni giorni, seguiti dalla disidratazione nelle soluzioni di etanolo seriale. L'inserimento del campione nella soluzione PTA direttamente dopo la fissazione della formalina può provocare alcune crepe dei tessuti a causa della rapida disidratazione. Pertanto, la disidratazione seriale è necessaria prima della colorazione PTA. Successivamente, gli esempi vengono macchiat...

La dissezione manuale e l'osservazione istologica sono tipicamente utilizzate per esaminare i tessuti umani, come i muscoli e i tessuti connettivi. Tuttavia, la dissezione manuale può facilmente danneggiare strutture delicate e l'osservazione istologica fornisce informazioni limitate sulle superfici trasversali piatte1,2. Pertanto, sono necessari metodi migliorati per esaminare i tessuti in modo più preciso ed efficiente.
La tomografia computerizzata convenzionale (TC) è generalmente utilizzata nella pratica clinica, ma manca della capacità di distinguere piccole strutture2,3. Micro X-ray CT (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali (3D) di piccole strutture da campioni, senza distruggerli. Tuttavia, la microCC ha applicazioni limitate perché solo i tessuti densi possono essere visualizzati chiaramente; non può essere utilizzato per differenziare i tessuti molli. Per superare questa limitazione, è possibile utilizzare gli agenti di colorazione. Agenti che migliorano il contrasto, come l'acido fosfotungstico (PTA), l'acido fosfolitillimpico e lo iodio di Lugol, migliorano il tasso di contrasto dei tessuti molli durante la scansione4,5. Diversi studi che confrontano questi agenti suggeriscono che PTA dimostra buone prestazioni ed è facile da gestire6,7,8.
Il legamento di mantenimento orbicularis (ORL) è una struttura delicata intorno all'orbita, che può essere facilmente danneggiata durante l'osservazione convenzionale9. Abbiamo esaminato e recuperato con successo informazioni 3D su questa struttura utilizzando microCT con PTA come agente di contrasto. Questo metodo può essere applicato a studi su altri tessuti umani, come il cuore e il fegato, con modifiche appropriate10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

La dissezione manuale e l'osservazione istologica sono metodi comuni utilizzati per studiare i tessuti umani. Tuttavia, la dissezione manuale può danneggiare le strutture delicate, mentre l'elaborazione e l'osservazione istologica forniscono informazioni limitate attraverso l'imaging trasversale. La tomografia computerizzata a raggi X micro -x (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali senza danneggiare i campioni. Tuttavia, mostra una limitata efficienza nella differenziazione delle parti dei tessuti molli. L'uso di agenti che migliorano il contrasto, come l'acido fosfotungtico (PTA), può risolvere questo problema migliorando il contrasto dei tessuti molli. Abbiamo implementato microCT con PTA per studiare il legamento di mantenimento dell'orbicularis umano (ORL), che è una struttura delicata nell'area dell'orbita. In questo metodo, i campioni raccolti sono fissati in formalina, disidratati in soluzioni di etanolo seriale e macchiati con una soluzione PTA. Dopo la colorazione, vengono eseguite la scansione microCT, la ricostruzione 3D e l'analisi. La pelle, i legamenti e i muscoli possono essere visualizzati chiaramente con questo metodo. Le dimensioni del campione e la durata della colorazione sono caratteristiche essenziali del metodo. Lo spessore del provino adatto era di circa 5-7 mm, al di sopra dei quali il processo è stato rallentato, e la durata ottimale era di 5-7 giorni, al di sotto del quale occasionalmente si è verificato un buco vuoto nella zona centrale. Per mantenere la posizione e la direzione dei piccoli pezzi durante il taglio, si consiglia di cucire sulla stessa regione di ogni parte. Inoltre, sono necessarie analisi preliminari della struttura anatomica per identificare correttamente ogni pezzo. Parafilm può essere utilizzato per prevenire l'essiccazione, ma occorre prestare attenzione per evitare la distorsione del campione. La nostra osservazione multidirezionale ha mostrato che l'ORL è composto da una rete multistrato di piastre continue, piuttosto che fibre simili a fili, come riportato in precedenza. Questi risultati suggeriscono che la scansione microCT con PTA è utile per esaminare compartimenti specifici all'interno di strutture complesse del tessuto umano. Può essere utile nelle analisi dei tessuti tumorali, tessuti nervosi, e vari organi, come il cuore e il fegato.

La ricostruzione dettagliata dell'ORL è stata realizzata mediante microCT con preparazione PTA (Figura 4). La struttura fibromuscolare ligesi che si estende obliquamente tra il derma e il periosteo è stata distintamente osservata (Figura 4A). Nella vista coronale (Figura 4B), la quantità e la complessità delle fibre sono aumentate lateralmente. Nella vista orizzontale (Figura 4C), è stata osservata...

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Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

La tomografia computerizzata a raggi X microagrafica è efficace nell'ottenere informazioni tridimensionali da campioni umani non danneggiati, ma ha un successo limitato nell'osservazione dei tessuti molli. L'uso di agente di contrasto dell'acido fosfoca e può risolvere questo problema. Abbiamo implementato questo agente di contrasto per esaminare i tessuti fibromuscolari delicati umani (l'orbicularis che mantiene il legamento).

Uso della micrografia computerizzata a raggi X con preparazione dell'acido fosfongstico per visualizzare il tessuto fibromuscolare umano

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Implementiamo microCT con acido fosfotungstico per migliorare il contrasto dei tessuti molli nell'indagine non invasiva del legamento umano di mantenimento dell'orbicularis, una struttura delicata all'interno dell'area dell'orbita. Questo protocollo è stato ottimizzato per aiutare i ricercatori nello studio non invasivo dei tessuti molli umani ed è semplice da eseguire con una ragionevole quantità di spesa. Per ottenere i campioni, utilizzare prima una matita colorata per indicare l'area di taglio sulla pelle per la raccolta del campione.Conferma che la linea marcata si estende medialmente fino a un campus mediale, lateralmente a un campus laterale, in modo superiore a un bordo superiore della palpebra inferiore e inferiore a un centimetro sotto la linea dal bordo orbitale. Successivamente, utilizzare una lama per tagliare i tessuti facciali lungo la linea contrassegnata, assicurandosi che il taglio sia abbastanza profondo da far toccare l'osso alla punta della lama. Il campione raccolto deve includere la pelle, il tessuto sottocutaneo, il muscolo, il grasso e il periosteo.Al momento della raccolta, fissare immediatamente il campione in formalina al 10% per cinque-sette giorni a temperatura ambiente. Alla fine del periodo di fissazione, affettare il campione in tre pezzi spessi da cinque a sette millimetri. Utilizzare un ago e un filo nero per cucire il lato superolaterale di ogni campione in modo che la direzione del campione possa essere determinata in punti temporali successivi.Disidratare il campione in una serie crescente di concentrazione di etanolo per un giorno per concentrazione, lasciando i campioni nella soluzione di etanolo al 70% fino a quando non vengono macchiati. Una settimana prima che sia programmata la scansione della tomografia del microcomputer, aggiungere 2,1 grammi di PTA a 210 millilitri di etanolo al 70% e posizionare la soluzione su uno shaker a 55-60 rotazioni al minuto. Preparare tre contenitori di plastica da 70 millilitri per ogni pezzo affettato.Quando il colorante si è sciolto nella soluzione alcolica, riempire i contenitori con la soluzione. Posizionare un campione in ogni contenitore di 1%PTA e agitare i campioni a 55-60 rotazioni al minuto per cinque o sette giorni. Al termine della colorazione, conservare i campioni in etanolo fresco al 70% per una settimana per prepararsi alla scansione.Per la scansione microCT, avvolgere i campioni in Parafilm per evitare l'asciugatura e posizionare un campione sul vassoio dello scanner. Impostare la tensione di sorgente dello scanner su 70 kilovolt, la corrente di sorgente a 114 microarti, il filtro in alluminio a 0,5 millimetri, la dimensione del pixel dell'immagine a 20 micrometri quadrati, i pixel a 2.240 per 2,240, l'esposizione a 500 millisecondi e il passaggio di rotazione a 0,3 gradi. Quindi, avviare la scansione.Al termine dell'analisi, aprire il software di ricostruzione e selezionare Azioni e Apri Set di dati per avviare i file analizzati. Selezionate la scheda Impostazioni (Settings) e impostate la riduzione degli artefatti dell'anello su sette e la correzione di indurimento del fascio. Per iniziare la ricostruzione, selezionare Avvia.I dati finali saranno memorizzati nella cartella designata. Al termine della ricostruzione, aprire il software di ridimensionamento dei file e selezionare Origine set di dati per avviare i file ricostruiti. Selezionare jpg nella scheda Set di dati di destinazione e selezionare l'opzione Ridimensionamento 1/2 con l'opzione Qualità senza interpolazione Quindi regolare la barra delle diapositive su 100 nella scheda Compressione immagine e avviare la conversione.Per la ricostruzione 3D, aprire il software di rendering del volume 3D e selezionare Azioni e Carica dati volume. Per regolare la luminosità e il livello di contrasto, modificare la funzione di trasferimento della forma nell'istogramma della scheda Editor funzioni di trasferimento. Selezionate Opzioni (Options) e Illuminazione (Lighting) e selezionate le icone Ombre (Shadows) e Illuminazione superficie (Surface Lighting) per ottenere un tono di modellazione realistico.Fare clic e trascinare, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare per spostare e ruotare l'immagine 3D per trovare la visualizzazione migliore, scorrendo per ingrandire o ridurre come desiderato. Fare clic su Maiusc e trascinare per scorrere la posizione per visualizzare le immagini sezionali. Attivare l'icona Luce e regolare la barra di indicazione dell'illuminazione per trovare l'illuminazione migliore per la visualizzazione, quindi disattivare l'icona Luce e chiudere la scheda Illuminazione.Nella scheda Opzioni selezionare Mostra e ritaglia casella per nascondere la casella per l'immagine finale. Quindi, selezionare Azioni e Salva immagine per archiviare l'immagine. Questa ricostruzione dettagliata dell'ORL è stata ottenuta con microCT con preparazione PTA come dimostrato, consentendo la visualizzazione di una struttura fibromuscolare legamentosa che si estende obliquamente tra il derma e il periostio.Nella vista coronale, la quantità e la complessità delle fibre aumenta lateralmente. In vista orizzontale, si osserva un'elaborata meshwork con una formazione arborizzata. Nella vista sagittale, gli spessori delle fibre ORL diminuiscono in modo inferiore.Nel complesso, questa osservazione multidirezionale dimostra che l'ORL è costituito da una rete multistrato di piastre continue con variazioni nel numero e nello spessore delle fibre a seconda della loro posizione. Quando la durata della colorazione è insufficiente rispetto al volume di un campione, l'immagine finale può includere un foro vuoto nell'area centrale del campione. Altri agenti oltre alla PTA possono essere utilizzati e diversi agenti hanno diversi meriti o interessi di colorazione delle caratteristiche.Pertanto, è utile ottimizzare la regione di colorazione in base all'esperimento.

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