Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
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Este estudo foi apoiado por um subsídio de pesquisa do corpo docente da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei (6-2018-0099). Os autores agradecem às pessoas que doaram muito generosamente seus corpos para a faculdade de medicina da Universidade de Yonsei. Estamos gratos a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang por seu apoio técnico (membros da equipe do centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei). Nós somos gratos igualmente a Genoss co., Ltd. para o sistema de varredura de alta qualidade de microCT usado nesta pesquisa.

Todos os cadáveres utilizados neste estudo foram legalmente doados ao centro de educação em anatomia cirúrgica da faculdade de medicina da Universidade de Yonsei.
1. obtenção de amostras
<ol><li>Desenhe uma linha de incisão no cadáver com um lápis colorido para indicar a área de corte para a colheita da amostra. Verifique se a linha de incisão desenhada se estende medialmente a um canthus medial, lateralmente a um canthus lateral, superiormente a uma borda superior da pálpebra in...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Nós implementamos o microCT com preparação do PTA no exame de tecidos macios humanos. Resumidamente, os espécimes são colhidos e fixados em formalina por alguns dias, seguidos de desidratação em soluções de etanol serial. Coloc a amostra na solução do PTA diretamente depois que a fixação do formalina pode conduzir a algum rachamento do tecido devido à desidratação rápida. Conseqüentemente, a desidratação de série é necessária antes da mancha de PTA. Em seguida, as amostras são manchadas usando a s...

A dissecção manual e a observação histológica são tipicamente usadas para examinar os tecidos humanos, como músculos e tecidos conjuntivos. No entanto, a dissecção manual pode facilmente danificar estruturas delicadas, e a observação histológica fornece informações limitadas sobre superfícies planas transversais1,2. Portanto, métodos melhorados são necessários para examinar os tecidos de forma mais precisa e eficiente.
A tomografia computadorizada convencional (TC) é geralmente utilizada na prática clínica, mas carece da capacidade de distinguir pequenas estruturas2,3. O micro raio X CT (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional (3D) de estruturas pequenas dos espécimes, sem destruí-los. Entretanto, microCT tem aplicações limitadas porque somente os tecidos densos podem ser visualizados claramente; Ele não pode ser usado para diferenciar os tecidos moles. Para superar esta limitação, os agentes de coloração podem ser usados. Os agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), o ácido foshomolíbdico e o iodo de Lugol, melhoram a taxa de contraste dos tecidos moles durante a digitalização4,5. Vários estudos comparando esses agentes sugerem que a PTA demonstra bom desempenho e é de fácil manuseio6,7,8.
O ligamento de retenção de orbicularis (ORL) é uma estrutura delicada em torno da órbita, que pode facilmente ser danificada durante a observação convencional9. Nós examinamos e recuperado com sucesso a informação 3D nesta estrutura usando microCT com o PTA como um agente do contraste. Este método pode ser aplicado a estudos sobre outros tecidos humanos, como o coração e o fígado, com modificações apropriadas10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

A dissecção manual e a observação histológica são métodos comuns usados para investigar tecidos humanos. Entretanto, a dissecção manual pode danificar estruturas delicadas, quando o processamento e a observação histológica fornecerem a informação limitada com a imagem latente transversal. O micro tomography computado do raio X (microCT) é uma ferramenta eficaz para obter a informação tridimensional sem danificar espécimes. Entretanto, mostra a eficiência limitada em diferenciar partes macias do tecido. O uso de agentes que melhoram o contraste, como o ácido fosfotúngstico (PTA), pode resolver este problema melhorando o contraste do tecido macio. Nós implementamos o microCT com o PTA para investigar o ligamento de retenção do orbicularis humano (ORL), que é uma estrutura delicada na área da órbita. Neste método, os espécimes colhidos são fixados em formalina, desidratados em soluções de etanol serial, e coradas com uma solução de PTA. Após a coloração, a varredura de microCT, a reconstrução 3D, e a análise são executadas. A pele, os ligamentos, e os músculos podem claramente ser visualizados usando este método. O tamanho da amostra e a duração da coloração são características essenciais do método. A espessura adequada do espécime foi de cerca de 5 – 7 mm, acima da qual o processo foi retardado, e a duração ótima foi de 5 a 7 dias, abaixo do qual um buraco vazio na área central ocasionalmente ocorreu. Para manter a localização e a direção de peças pequenas durante o corte, é recomendável costurar na mesma região de cada peça. Além disso, análises preliminares da estrutura anatômica são necessárias para identificar corretamente cada peça. Parafilm pode ser usado para impedir a secagem, mas o cuidado deve ser tomado para impedir a distorção do espécime. Nossa observação multidirecional mostrou que o ORL é compor de um malha multicamada de placas contínuas, um pouco do que a fio-como fibras, como relatado previamente. Estes resultados sugerem que a varredura de microCT com PTA seja útil para examinar compartimentos específicos dentro das estruturas complexas do tecido humano. Pode ser útil nas análises de tecidos de câncer, tecidos nervosos e vários órgãos, como o coração e o fígado.

A reconstrução detalhada do ORL foi alcançada pela Microtc com a preparação da PTA (Figura 4). A estrutura fibromuscular ligamentar que se estende obliquamente entre a derme e o periósteo foi distintamente observada (figura 4a). Na visão coronal (Figura 4B), a quantidade e a complexidade das fibras aumentaram lateralmente. Na visão horizontal (Figura 4C), observou-se um trabalho de malha elabora...

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Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

O micro tomography computado do raio X é eficaz em obter a informação tridimensional dos espécimes humanos não danificados mas tem o sucesso limitado em observar os tecidos macios. O uso do agente do contraste do ácido fosfotúngstico pode resolver esta edição. Nós implementamos este agente do contraste para examinar tecidos fibromusculares delicados humanos (o ligamento de retenção dos orbicularis).

Uso do micro tomography computado do raio X com preparação ácida phosphotungstic para visualizar o tecido fibromuscular humano

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Implementamos microCT com ácido fosfotungstic para aumentar o contraste do tecido mole na investigação não invasiva do ligamento de retenção de orbicularis humanos, uma estrutura delicada dentro da área de órbita. Este protocolo foi otimizado para auxiliar os pesquisadores na investigação não invasiva de tecidos moles humanos e é simples de executar com uma quantidade razoável de despesas. Para obter as amostras, primeiro utilize um lápis colorido para indicar a área de corte na pele para a colheita da amostra.Confirme que a linha marcada se estende mediadamente a um campus medial, lateralmente a um campus lateral, superiormente a uma borda superior da pálpebra inferior, e inferiormente a um centímetro abaixo da linha da borda orbital. Em seguida, use uma lâmina para cortar os tecidos faciais ao longo da linha marcada, certificando-se de que o corte é profundo o suficiente para a ponta da lâmina tocar o osso. A amostra colhida deve incluir a pele, tecido subcutâneo, músculo, gordura e periósteo.Após a coleta, fixar imediatamente a amostra em 10% de formalina por cinco a sete dias em temperatura ambiente. Ao final do período de fixação, corte a amostra em três pedaços de cinco a sete milímetros de espessura. Use uma agulha e uma linha preta para costurar o lado superolateral de cada amostra de modo que a direção da amostra possa ser determinada em pontos de tempo posteriores.Desidratar a amostra em uma série ascendente de concentração de etanol por um dia por concentração, deixando as amostras na solução de 70% de etanol até que estejam manchando. Uma semana antes da tomografia do microcomputador ser agendada, adicione 2,1 gramas de PTA a 210 mililitros de 70% de etanol e coloque a solução em um shaker a 55 a 60 rotações por minuto. Prepare três recipientes plásticos de 70 mililitros para cada peça fatiada.Quando o corante tiver se dissolvido na solução de álcool, encha os recipientes com a solução. Coloque uma amostra em cada recipiente de 1%PTA, e agite as amostras em 55 a 60 rotações por minuto durante cinco a sete dias. Quando a mancha estiver completa, armazene as amostras em 70% de etanol fresco por uma semana para se preparar para a varredura.Para a varredura de microCT, enrole as amostras em Parafilm para evitar a secagem e coloque uma amostra na bandeja do scanner. Ajuste a tensão de origem do scanner para 70 quilovolts, a corrente de origem para 114 microamps, o filtro de alumínio para 0,5 milímetros, o tamanho do pixel da imagem para 20 micrômetros quadrados, os pixels para 2.240 por 2.240, a exposição a 500 milissegundos, e o passo de rotação para 0,3 graus. Em seguida, inicie a varredura.Quando a digitalização estiver concluída, abra o software de reconstrução e selecione Ações e Conjunto de Dados Aberto para iniciar os arquivos digitalizados. Selecione a guia Configurações e defina a redução dos artefatos do anel para sete e a correção de endurecimento do feixe. Para começar a reconstrução, selecione Iniciar.Os dados finais serão armazenados na pasta designada. No final da reconstrução, abra o software de redimensionamento de arquivos e selecione o conjunto de dados Source para iniciar os arquivos reconstruídos. Selecione jpg na guia conjunto de dados Destino e selecione a opção 1/2 Redimensionamento com a opção Qualidade sem interpolação Em seguida, ajuste a barra de slides para 100 na guia de compactação de imagem e inicie a conversão.Para reconstrução 3D, abra o software de renderização de volume 3D e selecione Ações e Dados de Volume de Carga. Para ajustar o brilho e o nível de contraste, modifique a função de transferência de forma no histograma na guia Editor de Função de Transferência. Em seguida, selecione Opções e Iluminação e selecione os ícones sombras e iluminação de superfície para obter um tom de modelagem realista.Clique e arraste e clique com o botão direito do mouse e arraste para mover e girar a imagem 3D para encontrar a melhor visualização, rolando para ampliar ou sair conforme desejado. Clique em Mudar e arraste para deslizar o local para ver as imagens seccionais. Acenda o ícone Luz e ajuste a barra de indicação de iluminação para encontrar a melhor iluminação para visualização, em seguida, desligue o ícone Luz e feche a guia Iluminação.Na guia Opções, selecione Mostrar e Cortar caixa para ocultar a caixa para a imagem final. Em seguida, selecione Ações e Salvar imagem para armazenar a imagem. Esta reconstrução detalhada do ORL foi realizada por microCT com preparação de PTA como demonstrado, permitindo a visualização de uma estrutura fibromuscular ligamentou que se estende obliquamente entre a dermis e o peristo.Na visão coronal, a quantidade e a complexidade das fibras aumentam lateralmente. Na visão horizontal, observa-se um elaborado trabalho de malha com formação arborizada. Na visão sagital, as espessuras das fibras ORL diminuem inferiormente.No geral, esta observação multidirecional comprova que o ORL é composto por uma malha multicamadas de placas contínuas com variações no número e espessura das fibras, dependendo de sua localização. Quando a duração da coloração é insuficiente em comparação com o volume de um espécime, a imagem final pode incluir um buraco vazio na área central do espécime. Outros agentes ao lado do PTA podem ser usados e diferentes agentes têm diferentes méritos ou características de coloração.Portanto, é útil otimizar a região de coloração de acordo com o seu experimento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Caracterização de escamas de peixe multi-camadas (<em&gt; Atractosteus espátula</em&gt;) Usando Nanoindentação, X-ray CT, FTIR, e SEM

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Rígida incorporação de fixo e manchado, inteiro, espécimes de milímetro-escala para histologia seção livre 3D por Microtomografia computadorizada

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...