Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue at JoVE.com

Это исследование было поддержано профессорско-преподавательским составом Медицинского колледжа Университета Yonsei (6-2018-0099). Авторы благодарят людей, которые очень щедро пожертвовали свои тела в Медицинский колледж Университета Yonsei. Мы благодарны Чжун Хо Киму и Чон Хо Бангу за их техническую поддержку (сотрудники Центра обучения хирургической анатомии в Медицинском колледже Университета Енсея). Мы также благодарны Genoss Co., Ltd. за высококачественную систему микрокт-сканирования, используемую в этом исследовании.

Все трупы, использованные в этом исследовании, были юридически пожертвованы В Центре образования хирургической анатомии в Медицинском колледже Университета Yonsei.
1. Получение образцов
<ol><li>Нарисуйте линию разреза на трупе цветным карандашом, чтобы указать область резки...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Мы внедрили микроКТ с препаратом ПТА при изучении мягких тканей человека. Вкратце, образцы собирают и фиксируют в формалине в течение нескольких дней, а затем обезвоживание в серийных растворах этанола. Размещение образца в раствор PTA непосредственно после фиксации формалина может при...

Ручное вскрытие и гистологическое наблюдение обычно используются для изучения тканей человека, таких как мышцы и соединительные ткани. Тем не менее, ручное вскрытие может легко повредить деликатные структуры, и гистологическое наблюдение предоставляет ограниченную информацию о плоских поперечных поверхностях1,2. Поэтому необходимы усовершенствованные методы для более точного и эффективного изучения тканей.
Обычная компьютерная томография (КТ) обычно используется в клинической практике, но ей не хватает способности различать небольшие структуры2,3. Микрорентгеновская КТ (микроКТ) является эффективным инструментом для получения трехмерной (3D) информации о мелких структурах из образцов, не разрушая их. Тем не менее, microCT имеет ограниченное применение, потому что только плотные ткани могут быть визуализированы четко; он не может быть использован для дифференциации мягких тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивающие агенты могут быть использованы. Контрастно-улучшающие агенты, такие как фосхотунгстовая кислота (ПТА), фосфомоллипидная кислота и йод Лугола, улучшают скорость контрастности мягких тканей при сканировании4,5. Несколько исследований, сравнивая эти агенты показывают, что PTA демонстрирует хорошую производительность и легко обрабатывать6,7,8.
Orbicularis сохраняя связки (ORL) является деликатной структурой вокруг орбиты, которые могут быть легко повреждены во время обычного наблюдения9. Мы изучили и успешно извлекли 3D-информацию об этой структуре с помощью микроКТ с PTA в качестве контрастного агента. Этот метод может быть применен к исследованиям на других человеческих тканях, таких как сердце и печень, с соответствующими изменениями10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

Ручное вскрытие и гистологическое наблюдение являются распространенными методами, используемыми для исследования тканей человека. Однако ручное вскрытие может повредить хрупкие структуры, в то время как обработка и гистологическое наблюдение предоставляют ограниченную информацию посредством поперечного сечения. Микрорентгенй компьютерной томографии (microCT) является эффективным инструментом для получения трехмерной информации без повреждения образцов. Тем не менее, он показывает ограниченную эффективность в дифференциировании мягких частей ткани. Использование контрастно-улучшающих агентов, таких как фосхотунгстовая кислота (ПТА), может решить эту проблему путем улучшения контраста мягких тканей. Мы внедрили микроКТ с PTA для исследования человеческой orbicularis сохраняя связки (ORL), которая является деликатной структурой в области орбиты. В этом методе собранные образцы фиксируются в формалине, обезвоживаются в серийных растворах этанола и окрашиваются раствором PTA. После окрашивания проводится микрокт-сканирование, 3D-реконструкция и анализ. Кожа, связки и мышцы могут быть четко визуализированы с помощью этого метода. Размер образца и продолжительность окрашивания являются существенными особенностями метода. Толщина подходящего образца составляла около 5-7 мм, выше которых процесс замедлился, а оптимальная продолжительность составляла 5-7 дней, ниже которых время от времени происходило пустое отверстие в центральной части. Для поддержания расположения и направления мелких кусочков во время резки рекомендуется шитье на одной и той же области каждой части. Кроме того, для правильной идентификации каждой части необходим предварительный анализ анатомической структуры. Parafilm может быть использован для предотвращения сушки, но следует позаботиться о предотвращении искажения образца. Наше многонаправленное наблюдение показало, что ORL состоит из многослойной сетки непрерывных пластин, а не нитевидных волокон, как сообщалось ранее. Эти результаты свидетельствуют о том, что микрокТ-сканирование с помощью ПТА полезно для изучения конкретных отсеков в сложных структурах тканей человека. Это может быть полезно в анализе раковых тканей, нервных тканей и различных органов, как сердце и печень.

Детальная реконструкция ORL была достигнута с помощью микроКТ с помощью препарата ПТА(рисунок 4). Четко наблюдалась фибромышечная структура связок, косо между дермы и периостеем(рисунок 4A). В корональном представлении(рисунок 4B),количеств?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue at JoVE.com

Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

Микрорентгенй компьютерной томографии эффективен в получении трехмерной информации от неповрежденных образцов человека, но имеет ограниченный успех в наблюдении мягких тканей. Использование фосхотунгстовой кислоты контрастный агент может решить эту проблему. Мы внедрили этот контрастный агент для изучения тонких фибромышечных тканей человека (орбикулярная сохранительная связка).

Использование микрорентгенй компьютерной томографии с фосхотунгстовой кислотой Препарат для визуализации человека фибромышечной ткани

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Мы реализуем microCT с фосфотунгоновой кислотой для повышения контрастности мягких тканей в неинвазивном расследовании человеческой orbicularis сохраняя связки, деликатная структура в области орбиты. Этот протокол был оптимизирован, чтобы помочь исследователям в неинвазивном расследовании мягких тканей человека и прост в работе с разумной суммой расходов. Чтобы получить образцы, сначала используйте цветной карандаш, чтобы указать область резки на коже для сбора образцов.Подтвердите, что отмеченная линия распространяется medially на медиальный кампус, боковой к боковому кампусу, выше к превосходной границе нижнего века, и низко на один сантиметр ниже линии от орбитального обода. Далее, используйте лезвие, чтобы сократить ткани лица вдоль отмеченной линии, убедившись, что разрез достаточно глубок для кончика лезвия, чтобы коснуться кости. Собранный образец должен включать кожу, подкожные ткани, мышцы, жир и периостеум.После сбора, немедленно исправить образец в 10%формалин в течение пяти-семи дней при комнатной температуре. В конце периода фиксации нарежьте образец на три пяти-семимиллиметровые кусочки толщиной. Используйте иглу и черную нить, чтобы сшить суперолатерную сторону каждого образца таким образом, чтобы направление образца можно было определить в более поздних точках времени.Обезвоживаемый образец в восходящей серии концентрации этанола в течение одного дня за концентрацию, оставляя образцы в 70%этанола раствора, пока они не окрашивания. За неделю до запланированного микрокомпьютерного томографии добавьте 2,1 грамма ПТА в 210 миллилитров 70%этанола и поместите раствор на шейкер при 55-60 вращениях в минуту. Приготовьте три 70-миллилитровых пластиковых контейнера для каждого нарезанного куска.Когда краситель растворился в спиртовом растворе, заполните контейнеры раствором. Поместите один образец в каждый контейнер 1%PTA, и встряхните образцы на 55 до 60 вращений в минуту в течение пяти-семи дней. Когда окрашивание завершено, хранить образцы в свежем 70% этанола в течение одной недели, чтобы подготовиться к сканированию.Для сканирования microCT оберните образцы в Parafilm, чтобы предотвратить высыхание и поместите образец на поднос сканера. Установите напряжение источника сканера до 70 киловольт, исходный ток до 114 микроампер, алюминиевый фильтр до 0,5 миллиметра, размер пикселя изображения до 20 квадратных микрометров, пиксели до 2, 240 на 2 240, воздействие 500 миллисекунд и шаг вращения до 0,3 градуса. Затем инициируем сканирование.Когда сканирование завершено, откройте программное обеспечение для реконструкции и выберите Действия и Открытый набор данных для запуска отсканированных файлов. Выберите вкладку «Настройки» и установите уменьшение артефактов кольца до семи и коррекцию затвердевания луча. Чтобы начать реконструкцию, выберите Старт.Окончательные данные будут храниться в назначенной папке. В конце реконструкции откройте программное обеспечение для рестимизации файлов и выберите набор исходных данных для запуска восстановленных файлов. Выберите jpg на вкладке набор данных Destination и выберите опцию 1/2 Resizing с параметром качества No interpolation Затем отрегулируйте слайд-бар до 100 в вкладке сжатия изображения и начните преобразование.Для 3D-реконструкции откройте программное обеспечение для рендеринга громкости 3D и выберите данные об объемах действий и нагрузки. Чтобы настроить уровень яркости и контрастности, измените функцию передачи формы в гистограмме во вкладке Редактор функций передачи. Далее выберите параметры и освещение, а также выберите значки Shadows и Surface Lighting для достижения реалистичного тональности моделирования.Нажмите и перетащите, и правой кнопкой мыши и перетащить, чтобы переместить и повернуть 3D-изображение, чтобы найти лучшее представление, прокрутки, чтобы увеличить или выйти по желанию. Нажмите Shift и перетащите, чтобы сдвиньте место для просмотра секционных изображений. Включите значок Света и отрегулируйте планку показаний освещения, чтобы найти лучшее освещение для просмотра, затем выключите значок Light и закройте вкладку Lighting.Во вкладке Параметры выберите Show и Clipping Box, чтобы скрыть поле для окончательного изображения. Затем выберите Действия и сохранить изображение для хранения изображения. Эта детальная реконструкция ORL была достигнута microCT с подготовкой PTA, как попродемонстрировано, что позволяет визуализировать связки фибромосудистой структуры, простирающейся косо между дермой и периостеем.В корональной зрения, количество и сложность волокон увеличивается с боковой стороны. В горизонтальном виде наблюдается сложная сетка с беседчатым образованием. В сагиттальной точки зрения толщина волокон ORL уменьшается ниже.В целом, это многонаправлениюное наблюдение доказывает, что ORL состоит из многослойной сетки непрерывных пластин с вариациями в количестве и толщине волокон в зависимости от их расположения. Когда продолжительность окрашивания недостаточна по сравнению с объемом образца, окончательное изображение может включать пустое отверстие в центральной области образца. Другие агенты, кроме PTA могут быть использованы и различные агенты имеют различные достоинства или окрашивания особенности интересов.Таким образом, полезно оптимизировать область окрашивания в соответствии с вашим экспериментом.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Поверхности по изучению Гиалуроновая кислота Взаимодействие с раковыми клетками

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Малый и широкий угол рассеяния рентгеновских лучей исследования биологических макромолекул в растворе

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Анатомические реконструкций сердца человека венозной системы использованием контраста Компьютерная томография перфузии фиксированных экземпляров

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Characterization Of Multi-layered Fish Scales (Atractosteus spatula) Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Characterization Of Multi-layered Fish Scales Atractosteus spatula Using Nanoindentation, X-ray CT, FTIR, and SEM

Характеристика многослойных рыбьей чешуи (<em&gt; Atractosteus шпатель</em&gt;) Использование Наноиндентирование, РКТ, Фурье-ИК и SEM

The hierarchical architecture of protective biological materials such as mineralized fish scales, gastropod shells, ram&#8217;s horn, antlers, and turtle ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Компьютерная томография и оптическая томография остеогенеза ангиогенеза муфта для оценки интеграция кости черепа аутотрансплантатов и аллотрансплантатов

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

В Vivo количественной оценки структуры миокарда, функции, перфузии и жизнеспособности Использование сердца Микро-компьютерная томография

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

Правильное позиционирование и сдержанность крыса задние конечности для целенаправленного высоким разрешением изображений кости с помощью микро архитектуры в естественных условиях Микро Компьютерная томография

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

Perfusable сосудистая сеть с моделью ткани в устройстве Microfluidic

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Подготовка, очистки и использования липосомы, содержащие жирные кислоты

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Жесткая встраивание фиксированной и витражи, в целом, миллиметр масштаб образцов для секции Бесплатные 3D гистологии, Микро Компьютерная томография

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...