Name: use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue
Uploaded: 2019-09-05T14:30:00
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Este estudio fue apoyado por una beca de investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei (6-2018-0099). Los autores agradecen a las personas que generosamente donaron sus cuerpos a la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei. Agradecemos a Jun Ho Kim y Jong Ho Bang por su apoyo técnico (miembros del personal del Centro de Educación en Anatomía Quirúrgica del Colegio de Medicina de la Universidad de Yonsei). También estamos agradecidos a Genoss Co., Ltd. por el sistema de escaneo de microCT de alta calidad utilizado en esta investigación.

Todos los cadáveres utilizados en este estudio fueron legalmente donados al Centro de Educación de Anatomía Quirúrgica en la Facultad de Medicina de la Universidad de Yonsei.
1. Obtención de muestras
<ol><li>Dibuje una línea de incisión en el cadáver con un lápiz de color para indicar el área de corte para la cosecha de muestras. Compruebe que la línea de incisión dibujada se extiende medialmente a un canthus medial, lateralmente a un canthus lateral, superiormente a un borde sup...

<ol>
	<li>Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+three-dimensional+collagen+network+in+soft+tissues+using+contrast+agents+and+high+resolution+micro-CT:+Application+to+porcine+iliac+veins.">Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins.</a> Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).</li><li>Vymazalov&#225;, K., Vargov&#225;, L., Zikmund, T., Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possibilities+of+studying+human+embryos+and+foetuses+using+micro-CT:+a+technical+note.">The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note.</a> Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).</li><li>Tesa&#345;ov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+micro+computed-tomography+and+3D+printing+for+reverse+engineering+of+mouse+embryo+nasal+capsule.">Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule.</a> Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).</li><li>Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topochemistry+of+the+binding+of+phosphotungstic+acid+to+collagen.">Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen.</a> Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).</li><li>Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+PAS-phosphotungstic+acid-Diamine+Supra+Blue+FGL+and+immunological+reactions+for+type+I+collagen.">A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen.</a> Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+comparative+morphology:+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues.">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9 (11), (2009).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+Developmental+Biology:+A+Versatile+Tool+for+High-Contrast+3D+Imaging+at+Histological+Resolutions.">MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+collagen+distribution+in+articular+cartilage+using+contrastenhanced+micro-computed+tomography.">Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).</li><li>Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+the+orbicularis+retaining+ligament:+an+anatomical+study+using+micro+computed+tomography.">Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).</li><li>Dullin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#956;CT+of+ex-vivo+stained+mouse+hearts+and+embryos+enables+a+precise+match+between+3D+virtual+histology,+classical+histology+and+immunochemistry.">&#956;CT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry.</a> PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).</li><li>Zikmund, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+differentiation+resolution+3D+imaging+of+rodent+brain+by+X-ray+computed+microtomography.">High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography.</a> Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).</li><li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+iodine-based+contrast.">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast.</a> PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).</li><li>Nieminen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+histopathological+grading+of+osteochondral+tissue+using+contrast-enhanced+micro-computed+tomography.">3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography.</a> Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).</li><li>Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Details+of+Human+Middle+Ear+Morphology+Based+on+Micro-CT+Imaging+of+Phosphotungstic+Acid+Stained+Samples.">Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples.</a> Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).</li><li>Sutter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast-Enhanced+Microtomographic+Characterisation+of+Vessels+in+Native+Bone+and+Engineered+Vascularised+Grafts+Using+Ink-Gelatin+Perfusion+and+Phosphotungstic+Acid.">Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid.</a> Contrast Media &amp; Molecular Imaging. 2017, (2017).</li></ol>

Implementamos microCT con preparación de LA PTA en el examen de los tejidos blandos humanos. Brevemente, los especímenes se cosechan y fijan en formalina durante unos días, seguidos de la deshidratación en soluciones de etanol en serie. Colocar la muestra en la solución de la PTA directamente después de la fijación de la formalina puede resultar en algunos agrietamiento del tejido debido a la rápida deshidratación. Por lo tanto, se necesita deshidratación en serie antes de la tinción de la PTA. A continuación...

La disección manual y la observación histológica se utilizan normalmente para examinar los tejidos humanos, como los músculos y los tejidos conectivos. Sin embargo, la disección manual puede dañar fácilmente estructuras delicadas, y la observación histológica proporciona información limitada sobre superficies transversales planas1,2. Por lo tanto, se necesitan métodos mejorados para examinar los tejidos de manera más precisa y eficiente.
La tomografía computarizada convencional (TC) se utiliza generalmente en la práctica clínica, pero carece de la capacidad de distinguir estructuras pequeñas2,3. Micro Tc de rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional (3D) de pequeñas estructuras a partir de muestras, sin destruirlas. Sin embargo, la microCT tiene aplicaciones limitadas porque sólo los tejidos densos se pueden visualizar claramente; no se puede utilizar para diferenciar los tejidos blandos. Para superar esta limitación, se pueden utilizar agentes de tinción. Los agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), el ácido fosfomolíbódico y el yodo de Lugol, mejoran la tasa de contraste de los tejidos blandos durante la exploración4,5. Varios estudios que comparan estos agentes sugieren que la PTA demuestra un buen rendimiento y es fácil de manejar6,7,8.
El ligamento de retención orbicular (ORL) es una estructura delicada alrededor de la órbita, que puede dañarse fácilmente durante la observación convencional9. Examinamos y recuperamos con éxito información 3D sobre esta estructura utilizando microCT con PTA como agente de contraste. Este método se puede aplicar a estudios sobre otros tejidos humanos, como el corazón y el hígado, con las modificaciones apropiadas10,11,12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 Tungsto(&#8549;)phosphoric acid n-hydrate 
			Phosphotungstic acid</td>
			<td>Junsei</td>
			<td>84220-0410</td>
			<td>PTA powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTvox</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.7</td>
			<td>3D recon software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 1.7.0.4</td>
			<td>Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skyscan</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>1173</td>
			<td>MicroCT scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tconv</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>ver 2.0</td>
			<td>File resizing software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of micro x-ray computed tomography with phosphotungstic acid preparation to visualize human fibromuscular tissue

La disección manual y la observación histológica son métodos comunes utilizados para investigar los tejidos humanos. Sin embargo, la disección manual puede dañar estructuras delicadas, mientras que el procesamiento y la observación histológica proporcionan información limitada a través de imágenes transversales. La tomografía computarizada de micro rayos X (microCT) es una herramienta eficaz para obtener información tridimensional sin dañar las muestras. Sin embargo, muestra una eficiencia limitada en la diferenciación de partes de tejido blando. El uso de agentes que mejoran el contraste, como el ácido fosfotúltico (PTA), puede resolver este problema mejorando el contraste de los tejidos blandos. Implementamos microCT con PTA para investigar el ligamento de retención orbicularis humano (ORL), que es una estructura delicada en el área de la órbita. En este método, los especímenes cosechados se fijan en formalina, se deshidratan en soluciones de etanol en serie y se tiñen con una solución de PTA. Después de la tinción, se realiza la exploración de microCT, la reconstrucción 3D y el análisis. La piel, los ligamentos y los músculos se pueden visualizar claramente utilizando este método. El tamaño de la muestra y la duración de la tinción son características esenciales del método. El espesor adecuado de la muestra fue de unos 5-7 mm, por encima de los cuales el proceso se desaceleró, y la duración óptima fue de 5-7 días, por debajo de los cuales ocasionalmente se producía un agujero vacío en el área central. Para mantener la ubicación y la dirección de las piezas pequeñas durante el corte, se recomienda coser en la misma región de cada pieza. Además, se necesitan análisis preliminares de la estructura anatómica para identificar correctamente cada pieza. El parafilm se puede utilizar para evitar el secado, pero se debe tener cuidado para evitar la distorsión de la muestra. Nuestra observación multidireccional mostró que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas, en lugar de fibras similares a hilos, como se informó anteriormente. Estos resultados sugieren que la exploración por microCT con PTA es útil para examinar compartimentos específicos dentro de estructuras complejas de tejido humano. Puede ser útil en los análisis de tejidos cancerosos, tejidos nerviosos y varios órganos, como el corazón y el hígado.

La reconstrucción detallada del ORL se logró mediante microCT con preparación de la PTA(Figura 4). La estructura fibromuscular ligamentosa que se extiende oblicuamente entre la dermis y el periosteum se observó claramente(Figura 4A). En la vista coronal(Figura 4B),la cantidad y complejidad de las fibras aumentó lateralmente. En la vista horizontal(Figura 4C),se observó un elaborado mallado con una...

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Use of Micro X-ray Computed Tomography with Phosphotungstic Acid Preparation to Visualize Human Fibromuscular Tissue

La tomografía computarizada de micro rayos X es eficaz para obtener información tridimensional de muestras humanas no dañadas, pero tiene un éxito limitado en la observación de tejidos blandos. El uso de agente de contraste de ácido fosfotúmético puede resolver este problema. Implementamos este agente de contraste para examinar los tejidos fibromusculares delicados humanos (el ligamento de retención orbicularis).

Uso de tomografía computarizada de micro rayos X con preparación de ácido fosfotúrtico para visualizar el tejido fibromuscular humano

Manual dissection and histological observation are common methods used to investigate human tissues. However, manual dissection can damage delicate ...

Implementamos microCT con ácido fosfotúngstico para mejorar el contraste de tejido blando en la investigación no invasiva del ligamento de retención de orbicularis humanos, una estructura delicada dentro del área de la órbita. Este protocolo ha sido optimizado para ayudar a los investigadores en la investigación no invasiva de tejidos blandos humanos y es fácil de realizar con una cantidad razonable de gastos. Para obtener las muestras, utilice primero un lápiz de color para indicar el área de corte en la piel para la recolección de la muestra.Confirme que la línea marcada se extiende medialmente a un campus medial, lateralmente a un campus lateral, superiormente a un borde superior del párpado inferior, e inferiormente a un centímetro por debajo de la línea del borde orbital. A continuación, usa una cuchilla para cortar los tejidos faciales a lo largo de la línea marcada, asegurándote de que el corte sea lo suficientemente profundo como para que la punta de la hoja toque el hueso. La muestra cosechada debe incluir la piel, el tejido subcutáneo, el músculo, la grasa y el periosteo.Tras la recolección, fije inmediatamente la muestra en 10% de formalina durante cinco a siete días a temperatura ambiente. Al final del período de fijación, corte la muestra en tres piezas de cinco a siete milímetros de espesor. Utilice una aguja y un hilo negro para coser el lado superolateral de cada muestra de manera que la dirección de la muestra se pueda determinar en puntos de tiempo posteriores.Deshidratar la muestra en una serie de concentración ascendente de etanol durante un día por concentración, dejando las muestras en la solución de etanol al 70% hasta que se estén manchando. Una semana antes de que se programe la tomografía por microcomputadora, agregue 2,1 gramos de PTA a 210 mililitros de 70% de etanol y coloque la solución en una coctelera en 55 a 60 rotaciones por minuto. Prepare tres recipientes de plástico de 70 mililitros para cada pieza en rodajas.Cuando el tinte se haya disuelto en la solución de alcohol, llene los recipientes con la solución. Coloque una muestra en cada recipiente de 1%PTA y agite las muestras a 55 a 60 rotaciones por minuto durante cinco a siete días. Una vez completada la tinción, almacene las muestras en un 70% de etanol fresco durante una semana para preparar el escaneo.Para el escaneo microCT, envuelva las muestras en Parafilm para evitar el secado y coloque una muestra en la bandeja del escáner. Establezca el voltaje de origen del escáner en 70 kilovoltas, la corriente de origen en 114 microamperios, el filtro de aluminio en 0,5 milímetros, el tamaño de píxel de imagen en 20 micrómetros cuadrados, los píxeles a 2, 240 por 2, 240, la exposición a 500 milisegundos y el paso de rotación a 0,3 grados. A continuación, inicie el análisis.Una vez finalizada la exploración, abra el software de reconstrucción y seleccione Acciones y Abrir conjunto de datos para iniciar los archivos escaneados. Seleccione la pestaña Configuración y establezca la reducción de los artefactos de anillo en siete y la corrección de endurecimiento de viga. Para comenzar la reconstrucción, seleccione Inicio.Los datos finales se almacenarán en la carpeta designada. Al final de la reconstrucción, abra el software de cambio de tamaño de archivo y seleccione Conjunto de datos de origen para iniciar los archivos reconstruidos. Seleccione jpg en la pestaña Conjunto de datos de destino y seleccione la opción Cambiar el tamaño 1/2 con la opción Calidad de Sin interpolación A continuación, ajuste la barra de diapositivas a 100 en la pestaña Compresión de imagen e inicie la conversión.Para la reconstrucción 3D, abra el software de representación de volúmenes 3D y seleccione Acciones y Cargar datos de volumen. Para ajustar el brillo y el nivel de contraste, modifique la función de transferencia de forma en el histograma en la pestaña Editor de funciones de transferencia. A continuación, seleccione Opciones e Iluminación y seleccione los iconos Sombras e Iluminación de superficie para lograr un tono de modelado realista.Haga clic y arrastre, y haga clic con el botón derecho y arrastre para mover y girar la imagen 3D para encontrar la mejor vista, desplazándose para acercar o alejar como desee. Haga clic en Mayús y arrastre para deslizar el lugar para ver las imágenes seccionales. Encienda el icono Luz y ajuste la barra de indicación de iluminación para encontrar la mejor iluminación para ver, luego apague el icono Luz y cierre la pestaña Iluminación.En la pestaña Opciones, seleccione Mostrar y recortar cuadro para ocultar el cuadro de la imagen final. A continuación, seleccione Acciones y Guardar imagen para almacenar la imagen. Esta reconstrucción detallada del ORL se logró mediante microCT con la preparación de la PTA como se demostró, permitiendo la visualización de una estructura fibromuscular ligamentosa que se extendía oblicuamente entre la dermis y el periosteum.En la vista coronal, la cantidad y complejidad de las fibras aumenta lateralmente. En vista horizontal, se observa una malla elaborada con una formación arbórea. En la vista sagital, los espesores de las fibras ORL disminuyen de manera inferior.En general, esta observación multidireccional demuestra que el ORL se compone de una malla multicapa de placas continuas con variaciones en el número y grosor de las fibras dependiendo de su ubicación. Cuando la duración de la tinción es insuficiente en comparación con el volumen de una muestra, la imagen final puede incluir un agujero vacío en la zona central de la muestra. Otros agentes al lado de la PTA se pueden utilizar y diferentes agentes tienen diferentes méritos o características de tinción intereses.Por lo tanto, es útil optimizar la región de tinción de acuerdo con su experimento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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