Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

وقد حظي هذا العمل بدعم الرابطة الفرنسية لمكافحه الامراض العضلية مع برنامج التسلية الانتقالية. ويشكر المؤلفان الدكتور بيرلا رييس فرنانديز والدكتور ماثيو بوروك علي قراءتهما المتانيه للمخطوطة.

وأجريت التجارب وفقا للتشريع الفرنسي وتشريع الجماعة الاوروبيه (رقم الترخيص 11-00010).
1. اعداد اللثة تراغاكانث
<ol><li>في كوب زجاجي ، ذوب 6 غرام من مسحوق تراغاكانث في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. غطيه بورق القصدير واتركيه لمده 3 ساعات علي الأقل. يحرك أحيانا يدويا مع ملعقة معدنيه كما ...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

نخر myofiber هو نتيجة شائعه لممارسه الصدمة في العضلات العادية. ويعوض جيدا من قدره التجدد قويه من المولدين العضلات المحلية. ومع ذلك, في العديد من الحالات العضلات مثل في MDs, القدرة علي التجدد من الخلايا الأقمار الصناعية للخطر من قبل التهاب المفاصل المزمن والتليف المفرط. وتظهر النتائج الاخيره ان ?...

العضلات الهيكلية الشريطية تتكون أساسا من ألياف العضلات (ألياف العضلية) ، والتي هي المسؤولة عن وظيفة مقلص الطوعية المميزة. هذه الخلايا هي نوى ، وهياكل ما بعد الانقسام التي تدعم الإجهاد الميكانيكية التي تحدث اثناء الانكماش. الاستقرار الهيكلي لغشاء ميوليف (ساركولايما) ومصفوفة خارج الخلية هي حاسمه للتوازن الانسجه. خلايا الأقمار الصناعية تشكل العضلات الرئيسية السكان السلف في العضلات الهيكل العظمي ناضجه وموجودة في حاله هادئه في عضلات صحية. بعد وفاه ألياف العضلية ، يتم دعم تجديد العضلات بواسطة خلايا الأقمار الصناعية التي تتبع البرنامج العضلي الذي ينطوي علي تنشيط الخلايا الساتليه ، والانتشار ، والتمايز ، والانصهار لتشكل في نهاية المطاف نوى ليف جديده.
يمكن ان يحدث زوال ألياف العضلية في حالات العضلات المتعددة ، بما في ذلك الصدمات الميكانيكية ، وإصابات نقص التروية ، أو حثل العضلي ، ويرتبط بالتشكل الميت للخلايا النافقة1،2. ويتميز الموت نخريه من نفاذيه السريع لغشاء البلازما والإفراج عن محتوي الخلية في المقصورة خارج الخلية3. ويمكن ان ينتج اما عن عمليه غير منظمه لا تنطوي علي اشاره الخلية السليمة (اي النخر العرضي) ، أو مسار منظم داخل الخلايا (اي النخر المنظم). في ألياف العضلية ، وينظم كل من4 وغير المنظم5 عمليات يمكن ان يؤدي إلى نخر. ومن النتائج النموذجية للتهاب المفاصل هو الإفراج عن أنماط الجزيئات المرتبطة بالضرر ، وتفعيل استجابه التهابيه قويه6. لوحظ وجود الضامة في حوالي 48 h و 72 h بعد الاصابه7. وبالاضافه إلى دورها في أزاله الحطام نخريه ، فهي أيضا مهمة في تجديد العضلات8،9.
حثل العضلي (MDs) هي مجموعه غير متجانسة من الامراض التي غالبا ما تنجم عن عيب في بنيه ساركولايما. ضمور العضلات duchenne (DMD) هو مرض الاحداث المرتبطة ب X التي تؤثر علي ما يقرب من 1 من كل الولادات الذكور 3,500 في جميع انحاء العالم10، وسببه عدم وجود dystrophin التعبير في sarcolemma. الانحطاط المزمن للانسجه العضلية في DMD الأولاد يؤدي إلى ضعف العضلات المدقع والوفاات المبكرة. التهاب الناتج عن الموت نخريه يعزز السمية الخلوية ، ويعزز التليف العضلي وفقدان وظيفة العضلات11،12. العلاجات الحالية في التجارب السريرية التي تستهدف جذور الاضطرابات التنكسية العضلية ، مثل العلاج الجيني ، من المتوقع ان تخفف من التهاب المفاصل. ولذلك هناك حاجه إلى تقنيات بسيطه لقياس انحطاط العضلات بدقه.
يتم استخدام عده طرق بشكل روتيني لمراقبه فقدان ألياف العضلية في الجسم المجري. قياس النشاط الانزيمي من الكرياتين كيناز (CK) في الدم يسمح كميات موثوقه من النخر المستمر في انسجه العضلات والقلب. في الموقع ، وتلطيخ هيماتوكسيلين و ايوسين (H & E) هو الأسلوب الأكثر شعبيه المستخدمة حاليا في التشخيص لتقييم انحطاط التجديد أعاده النمذجة. بيد ان الأساس الجزيئي لوسم الخلايا الميتة & E لا يزال غير واضح. وعلاوة علي ذلك ، التعديلات اللون مما يوحي الموت ليف في تلطيخ H & E هي خفيه نسبيا ولا تسهل التحديد الكمي موثوق بها واستنساخها. طرق الكشف عن تجزئه الحمض النووي ، مثل المحطة الطرفية ديكسينوكليوديتيل الناقل dutp نك نهاية الوسم (tunel) ، التسمية ناقص الموت نخريه3. كما انها غير مهياه بشكل سيء لرصد وفاه الخلايا الخلوية مثل ألياف العضلية. حقن الاصباغ الحيوية ، مثل صبغه ايفان الزرقاء (EBD) ، يمثل بديلا مفيدا لتقييم ألياف العضلية التي فقدت سلامه ساركولايما ، ولكن ليس بالضرورة مريحه في بعض البروتوكولات التجريبية. فعلي سبيل المثال ، يمكن ان يؤثر وجود EBD في عينات الدم علي نتائج قياسات الكورونا التشيكية ، وهو فحص لوني. وعلاوة علي ذلك ، امتصاص داخل الخلايا من EBD يجعل التعاون المناعي تحديا. ولذلك ، فان الطريقة البديلة التي تسمح بالوسم المباشر للألياف العضلية التي تمر بالنخر هي ذات فائده.
تعتمد اليه عمل الاصباغ الحيوية علي فقدان سلامه غشاء البلازما في ألياف العضلية الميتة والامتصاص السلبي لصبغه الحقن. المثل ، امتصاص ميونوتيك بروتينات الدم مثل الزلال ، والتي EBD لديه تقارب قوي13،14، الغلوبولين المناعي G (مفتش) ، و15الغلوبولين. التالي فان وجود غير طبيعي للبروتينات الدم داخل ألياف العضلية يمثل علامات مريحه للتهاب المفاصل في الموقع. تلطيخ هذه البروتينات يمكن ان يكون بديلا لاستخدام الاصباغ الحيوية.
باستخدام امتصاص مفتش كعلامة علي فرط التعرق في الموقع, ويستخدم هذا البروتوكول لتقييم انحطاط العضلات في الامامي الظنبوبي (TA) من الفئران mdx dystrophin ناقص. ويقدم هذا الأسلوب مزايا كبيره علي التقنيات البديلة: 1) انها قابله للاستنساخ وبسيطه في تنفيذه ؛ 2) انه لا يتطلب اي علاج الحيوانية قبل جمع العضلات ، مثل حقن الاصباغ الحيوية المتداولة ، و 3) كما اي المناعية التقليدية ، فانه متوافق مع وضع العلامات المشتركة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

نخر ألياف العضلات (فرط التعرق) يلعب دورا مركزيا في التسبب في العديد من الحالات العضلية, بما في ذلك حثل العضلات. من المتوقع ان تخفف الخيارات العلاجية التي تعالج أسباب الضمور العضلي من انحطاط العضلات. لذلك ، هناك حاجه إلى طريقه لفحص وقياس مدي موت الخلايا في الخزعات العضلية. الطرق التقليدية لمراقبه تنكس ألياف العضلية في الموقع اما ضعيفه الكمية أو تعتمد علي حقن الاصباغ الحيوية. في هذه المقالة ، يوصف بروتوكول المناعية ان البقع ألياف العضلية الميتة عن طريق استهداف الغلوبولين المناعي G (مفتش) امتصاص من قبل ألياف العضلية. ويستند أسلوب امتصاص مفتش علي ميزات الخلية تميز زوال نخريه ، بما في ذلك 1) فقدان سلامه غشاء البلازما مع الإفراج عن الاضرار المرتبطة الأنماط الجزيئية و 2) امتصاص البروتينات البلازما. في الأجزاء المتقاطعة murine ، والمناعية المشتركة من ألياف العضلية ، والبروتينات مصفوفة خارج الخلية ، والماوس مفتش يسمح بالتحديد النظيف والمباشر للألياف العضلية مع مصير نخريه. هذه الطريقة البسيطة مناسبه للتحليل الكمي وقابله للتطبيق علي جميع الأنواع ، بما في ذلك العينات البشرية ، ولا تتطلب حقن صبغه حيوية. ويمكن أيضا تلطيخ من ألياف العضلية نخريه من امتصاص مفتش ان يقترن مع غيرها من المناعية المشتركة.

ألياف العضلية محاطه بمصفوفة خارج الخلية تحتوي علي laminin. الأحمر تلطيخ يحدد ميونوليف محيط ويسمح للتعرف عليها. ويظهر مفتش باللون الأخضر. النوى ملطخه DAPI ويتم العثور علي الأزرق تحت المجهر. ومع ذلك ، يتم عرض النوى باللون الأبيض هنا (الشكل 1). ومن المتوقع ان المناع...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

وصف هنا هو بروتوكول للمناعة المباشرة من ألياف العضلية الميتة في العضلات. الخلايا الميتة هي نفاذيه للبروتينات المصل ، بما في ذلك الغلوبولين المناعي G (مفتش). الكشف عن امتصاص مفتش من قبل myofibers يسمح لتحديد والتقدير الكمي من ألياف العضلية التي تخضع لنخر بغض المثل عن حاله العضلات.

المناعية انحطاط Myofiber في العضلات الخزعات

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

نخر myofiber هو سمة من الاضطرابات العصبية العضلية المتعددة ويلعب دورا مركزيا في التسبب في الأمراض. طريقة محددة وموثوق بها لتقييم انحطاط العضلات مهمة للتشخيص والبحوث الترجمية. تسمح هذه التقنية القابلة للتكيف للغاية وضع العلامات من مستضد متعددة في نفس الوقت في نفس المقطع داخل myofibers.فمن الممكن مع الأصباغ الحيوية. H & E تلطيخ هو أساليب تجريبية غير قابلة للتكيف لاعتداء موثوق بها وقابلة للتكرار. ومع ذلك، فإن تلطيخ امتصاص IgG محدد بالنسبة للخلايا العضلية النخرية وقابل للتطبيق على الخزعات البشرية.هذه التقنية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في جميع الاضطرابات العصبية العضلية التي تتميز بالتصلب العضلي. بعد إزالة الشعر من الساق من الفائدة وضع الذكور أربعة من العمر MDX الحيوان في موقف supine وتأمين الكفوف إلى لوحة الفلين. باستخدام مقص الدقة أو ملقط إزالة الجلد الساق من القدم إلى الركبة لفضح طول الساق وtiibialis الأمامي.استخدم المقص لإجراء شق بين الساق والبيبية الأمامية. استخدام ملقط لإزالة بعناية طبقة epimysium من سطح العضلات. في الكاحل، استخدم ملقط لعزل الوتر الأمامي من الوتر الآخر وسحب بلطف على الوتر لعزله عن الساق والعضلات المحيطة بها.عندما البطن الأمامي tibialis قد فصل تماما عقد وتر حتى أن يتم إرفاق فقط الجزء القريب من العضلات الأمامية tibialis إلى الركبة. وقطع بلطف وتر قريب أقرب ما يمكن إلى الرضفة. ضع الـ tibialis الأمامي على قطعة من الشاش المُخفف بخفة مع المالحة لتجنب التجفيف.تراجع جزئيا كوب يحتوي على 70 إلى 100 ملليلتر من ال isopentane في حاوية من النيتروجين السائل حتى الايسوبينتان في الجزء السفلي من كوب يصبح صلبا أبيض. بعناية ما قبل التسمية على الجانب الآخر من الفلين بحيث يمكن التعرف على خزعة بشكل صحيح بعد التجميد، وإضافة ما يقرب من 0.5 ملليلتر من العلكة tragacanth على 20 في 11 من 8 ملليمتر قطعة دائرية من الفلين. استخدام ملقط لتضمين تيبياليس الأمامي في جانب وتر اللثة.عقد العضلات مع محورها عمودي على سطح الفلين. يجب أن يبقى نصف جانب وتر الوتر على الأقل من الـ tibialis الأمامي مكشوفًا من اللثة. ثم سرعان ما تراجع الفلين مع العضلات جزءا لا يتجزأ من في المبردة، غير مجمدة إيسوبتينتان لمدة دقيقتين تقريبا للسماح التجميد الكامل.الحصول على أجزاء من الأنسجة المجمدة، تعيين درجة حرارة التبريد إلى ناقص 25 درجة مئوية واستخدام مركب درجة حرارة القطع الأمثل لإصلاح الأنسجة على كتلة القطع التبريد. تقليم العينة حتى يتم التوصل إلى البطن العضلات. الحصول على سبعة إلى 10 أقسام ميكرومتر جمع ما لا يقل عن قسمين لكل شريحة الزجاج وضع الشرائح في درجة حرارة الغرفة كما يتم التقاط المقاطع.السماح لتجفيف الأنسجة لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة في بيئة التهوية. ثم تخزين القسم في ناقص 80 درجة مئوية حتى انهم تلطيخ. المناعة مناعة الأنسجة.أولاً، ذوبان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل في بيئة التهوية. بعد ذلك، حدد الأقسام بقلم مبيد للماء. إصلاح الأنسجة مع 2٪ شبهformaldehyde لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة.في نهاية تثبيت شطف المقاطع مع اثنين من غسل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل. منع أي ربط غير محددة مع مصل الماعز 10٪ المخفف في برنامج تلفزيوني. بعد 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة التسمية الأقسام مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة، مخففة في مصل الماعز 5٪ لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، شطف الشرائح مع ثلاث غسلات 5 دقائق في برنامج تلفزيوني تتبع عن طريق وضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية الفلوروومي المناسبة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح مع ثلاثة يغسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني. قم بتركيب القسم بوسيلة فلورسنت للتصاعد تحتوي على 100 نانوغرام لكل ملليلتر من DAPI وزلة غطاء.ثم جفف الشرائح بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية قبل التصوير. عضلات تيبياليس الأمامية من أربعة أسابيع الفئران mdx القديمة غالبا ما تظهر ملامح غير متجانسة بما في ذلك المناطق المتضررة بشكل سيئ في المناطق التدهور وتجديد معا في نفس المقطع العرضي. تتأثر المناطق المتضررة أقل ما يقال العضلات تحتوي على myofibers من حجم كبير ومتجانس والنوى في كثافة منخفضة التي تقع أساسا في المحيط أو بين myofibers.IgG myofibers إيجابية عموما غائبة في مثل هذه الصحة أو المناطق المتضررة أقل ما يقال في حين IgG المناعية داخل myofibers يشير إلى myonecrosis. myofibers شكلت حديثا موجودة في حجم صغير في مراحلها المبكرة من التجدد توسيع تدريجيا كما دمج السلف العضلي في المساهمة في الخلية المتزامنة. خلال هذه العملية، و myonuclei لا تزال في مركز تجديد الأنسجة مع مجموعات من myofibers الصغيرة، نوىوسيد المركزية تشير إلى myofibers تجديدها مؤخرا لتقليل خطر القطع الأثرية من المهم أن تبقي في العضلات مباشرة عند تجميد الأنسجة وعند درجة الحرارة الصحيحة.وينبغي دائما التعامل مع إيسوبنتان وPFA بحذر وتحت غطاء محرك الدخان.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

إعداد واستخدام الآفات فانتوم الممارسة التشكيلية الخزعات إبرة الطموح

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

تقييم وظيفة عضلة من العضلات الباسطة لأصابع الطويلة<em&gt; خارج الجسم</em&gt; العضلات الظنبوبي الأمامي و<em&gt; في الموقع</em&gt; في الفئران

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) يسببها الشبكية البقعي والتجدد في الزرد: التركيب النسيجي والخصائص الوظيفية

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

الكشف عن البكتيريا المقيمة في الانسجه في المثانة الخزعات من قبل rRNA الفلورية 16S في الموقع التهجين

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

عزل Myofibrils من خزعات العضلات والهيكل العظمي وتحديد وظيفة المتعاقدة مع نانو نيوتن القرار نقل الطاقة

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

جمع خزعات العضلات الهيكل العظمى من المقصورة العليا من الإنسان Musculus Tibialis الأمامي للتقييم الميكانيكي

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

واحد Myofiber الثقافة المقايسة لتقييم وظائف الخلايا الجذعية العضلات الكبار Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...