Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Association Française contre les Myopathies med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres omhyggelige læsning af manuskriptet.

Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med den franske og europæiske fællesskabslovgivning (licensnummer 11-00010).
1. forberedelse af tragacanth Gum
<ol><li>I et glasbæger opløses 6 g traganth pulver i 100 ml deioniseret vand. Dæk med folie og lad i mindst 3 h. lejlighedsvis røre manuelt med en metalspatel, da blandingen hurtigt bliver viskøs.</li>
	<li>Lad traganth blandingen ligge ved 60 °c natten over i et vandbad eller i ovnen. Forsegl forsigtigt bægerglasset for at undg...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber nekrose er en almindelig konsekvens af traumatisk motion i normale muskler. Det er godt kompenseret af en kraftfuld regenerativ kapacitet af de lokale muskel progenitorer. Men i flere muskel tilstande som i MDS, er den regenerativ kapacitet af satellit celler kompromitteret af kronisk myonekrose og overdreven fibrose. Nylige fund viser, at muskelfibrene kan dø ved nekroptose, en reguleret form for nekrose. Mere specifikt kan hæmning af nekroptose blive en ny terapeutisk strategi for DMD behandling<sup class="x...

Tværstrieret skeletmuskulatur består hovedsageligt af muskelfibre (myofibers), som er ansvarlige for den karakteristiske frivillige kontraktile funktion. Disse celler er flerkernede, post-mitotiske strukturer, der understøtter mekanisk stress opstår under sammentrækning. Strukturel stabilitet af myofiber membranen (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrix er afgørende for vævs homøostase. Satellit celler udgør den vigtigste muskel progenitorpopulation i modne skeletmuskulatur og findes i en lysende tilstand i raske muskler. Efter myofiber død, er muskel regenerering understøttet af satellit celler efter et myogen program, der involverer satellit celle aktivering, spredning, differentiering, og fusion til sidst danne nye flerkernede myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, herunder mekaniske traumer, iskæmi-reperfusion skader, eller muskuløs dystrophies, og det er forbundet med den nekrotiske morfologi af døde celler1,2. Nekrotisk død er karakteriseret ved den hurtige permeabilitet af plasma membranen og frigivelse af celleindhold i det ekstracellulære rum3. Det kan skyldes enten en ureguleret proces, der ikke involverer nogen ordentlig celle signalering (dvs. utilsigtet nekrose), eller en orkestrated intracellulær pathway (dvs., reguleret nekrose). I myofibers, både regulerede4 og ureguleret5 processer kan føre til nekrose. En typisk konsekvens af myonecrosis er frigivelsen af skader-associerede molekyle mønstre, aktivering af en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen af makrofager er observeret på omkring 48 h og 72 h efter skade7. Udover deres rolle i clearance af nekrotiske vragrester, de er også vigtige i muskel regenerering8,9.
Muskel dystrophier (MDs) er en heterogen gruppe af patologier, som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en juvenil X-linked sygdom, der påvirker ca 1 ud af hver 3.500 mandlige fødsler på verdensplan10, og det er forårsaget af fraværet af dystrofin udtryk på sarcolemma. Kronisk degeneration af muskelvæv i DMD drenge fører til ekstrem muskelsvaghed og tidlig dødelighed. Betændelse som følge af nekrotisk død øger cytotoksicitet, og fremmer muskel fibrose og tab af muskelfunktion11,12. Behandlinger i øjeblikket i kliniske forsøg rettet mod rødderne af muskel degenerative lidelser, såsom genterapi, forventes at lindre myonekrose. Der er derfor behov for enkle teknikker til nøjagtig kvantificering af muskel degeneration.
Flere metoder bruges rutinemæssigt til at overvåge myofiber tab in vivo. Målingen af den enzymatiske aktivitet af kreatinkinase (CK) i blodet giver mulighed for pålidelig kvantificering af igangværende nekrose i muskler og hjerte væv. In situ, hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning er den mest populære metode, der i øjeblikket anvendes i diagnose for at vurdere degeneration-regenerering remodelling. Men det molekylære grundlag for H & E mærkning af døde celler er stadig uklar. Desuden farveændringer tyder myofiber død i H & E farvning er relativt subtile og ikke fremmer pålidelig og reproducerbar kvantificering. Metoder afslører DNA-fragmentering, såsom Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick ende mærkning (TUNEL), ufuldkomment etiket nekrotisk død3. De er også dårligt tilpasset til at overvåge død af syncytial celler såsom myofibers. Injektion af vitale farvestoffer, såsom Evan blå farvestof (EBD), repræsenterer et nyttigt alternativ til vurdering af myofibers, der har mistet integriteten af sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i nogle eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen af EBD i blodprøver påvirke resultaterne af CK målinger, en kolorimetrisk analyse. Desuden gør intracellulær optagelse af EBD medimmunolabelling udfordrende. Derfor er en alternativ metode til at tillade direkte mærkning af myofibers, der gennemgår nekrose, af interesse.
Virkningsmekanismen af vitale farvestoffer afhænger af tabet af plasma membranens integritet i nekrotiske myofibers og den passive optagelse af det injicerede farvestof. Tilsvarende, nekrotiske myofibers optagelse blodproteiner såsom albumin, for hvilke EBD har en stærk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale tilstedeværelse af blodproteiner inden for myofibers repræsenterer derfor bekvemme markører for myonekrose in situ. Farvning disse proteiner kan være et alternativ til brug af vitale farvestoffer.
Ved at bruge IgG-optagelse som markør for myonecrosis in situ anvendes denne protokol til at vurdere muskel degeneration i tibias forreste (Ta) af MDX dystrophin-mangelfulde mus. Denne metode giver betydelige fordele i forhold til alternative teknikker: 1) den er reproducerbar og enkel i sin udførelse; 2) det kræver ikke nogen dyre behandling forud for muskel indsamling, såsom injektion af cirkulerende vitale farvestoffer, og 3) som enhver konventionel immunolmærkning, det er foreneligt med co-mærkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Nekrose af muskelfibre (myonecrose) spiller en central rolle i patogenesen af flere muskel tilstande, herunder muskuløs dystrophies. Terapeutiske muligheder tackle årsagerne til muskuløs dystrofi patogenesen forventes at lindre muskel degeneration. Derfor er en metode til at assay og kvantificere omfanget af celledød i muskelbiopsier er nødvendig. Konventionelle metoder til at observere myofiber degeneration in situ er enten dårligt kvantitative eller stole på injektion af vitale farvestoffer. I denne artikel, en immunofluorescenstest protokol er beskrevet, at pletter nekrotiske myofibers ved at målrette immunglobulin G (IgG) optagelse af myofibers. IgG-optagelsesmetoden er baseret på celle funktioner, der karakteriserer den nekrotiske død, herunder 1) tabet af plasma membranens integritet med frigivelsen af skade relaterede molekylære mønstre og 2) optagelsen af plasmatiske proteiner. I murine tværsnit, den Co-immunolabelling af myofibers, ekstracellulære matrix proteiner, og mus IgG tillader ren og ligetil identifikation af myofibers med nekrotisk skæbne. Denne enkle metode er egnet til kvantitativ analyse og gælder for alle arter, herunder humane prøver, og kræver ikke injektion af vitale farvestof. Farvning af nekrotiske myofibre ved IgG-optagelse kan også kombineres med andre Co-immunolabelling.

Myofibers er omgivet af en Laminin-holdige ekstracellulære matrix. Rød farvning afgrænse myofibers periferi og giver mulighed for deres identifikation. IgG vises med grønt. Kerner farves med DAPI og findes blå under mikroskopet. Men, kerner er vist i hvidt her (figur 1). Der forventes en svag IgG-immunoreaktivitet i det ekstracellulære rum, som kan øges i tilfælde af betændelse. Grøn farvning i myofibers afspejler tilstedeværelsen af IgG.
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Beskrevet her er en protokol til direkte immun mærkning af nekrotiske myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiske celler er gennemtrængelig for serumproteiner, herunder immunglobulin G (IgG). Afslørende optagelsen af IgG ved myofibers tillader identifikation og kvantificering af myofibers, der gennemgår nekrose uanset muskel tilstand.

Immunolabelling myofiber degeneration i muskelbiopsier

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Myofiber nekrose er karakteristisk for flere neuromuskulære lidelser og spiller en central rolle i patogenese. En specifik, pålidelig metode til vurdering af muskeldegeneration er vigtig for diagnose og translationel forskning. Denne ekstremt fleksible teknik gør det muligt at mærke flere antigen som samme tid i samme afsnit inden for, at myofibers.Det er muligt med vitale farvestoffer. H&E farvning er en empirisk metode, der ikke kan tilpasses til pålidelig og reproducerbar bøjning. IgG optagelse farvning, dog, er specifik for nekrotiske muskelceller og gælder for menneskelige biopsier.Denne teknik kan give indsigt i alle neuromuskulære lidelser karakteriseret ved myonecrosis. Efter fjernelse af håret fra benet af interesse sted de fire uger gamle mandlige mdx dyr i liggende position og sikre poterne til en kork bord. Brug præcision saks eller scefæces fjerne benet huden fra foden til knæet for at udsætte hele længden af skinnebenet og skinneben.Brug saksen til at lave et snit mellem skinnebenet og skinnebenet forreste. Brug vicess til forsigtigt at fjerne epimysium lag fra overfladen af musklen. Ved anklen, bruge krafterne til at isolere skinnebialis forreste sener fra de andre sener og forsigtigt trække op på senen for at isolere den fra skinnebenet og de omkringliggende muskler.Når skinnebenssmerter mave har helt adskilt holde senen op, således at kun den proksimale del af skinnebenet forreste muskel er knyttet til knæet. Og forsigtigt afskære den proksimale senen så tæt som muligt på patella. Placer skinnebialis forreste på et stykke gaze let dæmpet med saltvand for at undgå tørring.Dyp delvist et bægerglas indeholdende 70 til 100 milliliter isopentan i en beholder med flydende nitrogen, indtil isopentanten i bunden af bægerglasset bliver et hvidt fast stof. Forsigtigt pre-label den anden side af propperne, således at biopsi kan identificeres korrekt efter frysning, og tilsæt ca 0,5 milliliter tragacanth tyggegummi på en 20 af 11 af 8 millimeter cirkulært stykke kork. Brug krafterne til at integrere skinnebensmotiver anterior i tandkødet distale senen side op.Holde musklen med sin akse vinkelret på korkoverfladen. Mindst halvdelen af senen side af skinnebenet forreste bør forblive afdækket af tyggegummi. Derefter hurtigt dyppe proppen med den indlejrede muskel i kølet, unfrozen isopentane i cirka to minutter for at tillade fuldstændig frysning.Få dele af det frosne væv, indstille kryostattemperaturen til minus 25 grader Celsius og bruge optimal skæretemperatur forbindelse til at fastsætte vævet på kryostatskæreblokken. Trim prøven, indtil muskel maven er nået. Der fremskaf os syv til 10 mikrometersektioner, der samler mindst to sektioner pr. glasrutsjebane, der placerer objektglassene ved stuetemperatur, efterhånden som sektionerne opfanges.Lad vævet tørre i mindst 20 minutter ved stuetemperatur i et ventileret miljø. Opbevar derefter sektionen på minus 80 grader Celsius, indtil de pletter. Immunlabel vævene.Tø først rutsjebanerne op ved stuetemperatur i mindst 15 minutter i det ventilerede miljø. Dernæst afgrænse sektioner med en hydrofob pen. Fix væv med 2% paraformaldehyd i 10 minutter i et fugtigt kammer.Ved afslutningen af en fiksering skylles sektionerne med to 5 minutters vask i frisk PBS pr vask. Der må blokeres for enhver ikke-specifik binding med 10 % gedeser fortyndet i PBS. Efter 1 time ved stuetemperatur mærke sektioner med en primær antistoffer af interesse, fortyndet i 5% gedeserum i 2 timer ved stuetemperatur.Ved inkubationens afslutning skylles objektglassene med tre 5 minutters vask i PBS ved at mærke med de relevante fluorophorekonjugerede sekundære antistoffer i 45 minutter ved stuetemperatur, der er beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes rutsjebanerne med tre 10 minutters vask i PBS. Sektionen monteres med et fluorescerende monteringsmedium, der indeholder 100 nanogram pr. milliliter DAPI og en dækselsseddel.Tør derefter dias natten over ved fire grader Celsius før billeddannelse. Tibialis forreste muskler fra fire uger gamle mdx mus ofte vise heterogene profiler, herunder dårligt ramte områder i degenererende og regenererende områder sammen i samme tværsnit. Upåvirket til mildt berørte muskelområder indeholder myofibers af en stor og homogen størrelse og kerner ved en lav tæthed, der hovedsageligt er placeret i periferien eller i mellem myofibers.IgG positive myofibers er generelt fraværende i sådanne sundhedsmæssige eller mildt ramte områder, mens IgG immunoraktivitet inden for myofibers indikerer myoneks. Nydannede myofibers er til stede i en lille størrelse på deres tidlige stadier af regenerering gradvist udvide som muskel stamfædiater sikring i bidrage til syncytial celle. Under denne proces forbliver myonuclei i midten af det regenererende væv med klynger af små, centralt nukleerede myofibers, der angiver nyligt regenererede myofibers For at minimere risikoen for artefakter er det vigtigt at holde i musklerne lige, når du fryser vævet og ved den korrekte temperatur.Isopentan og PFA bør altid håndteres med forsigtighed og under en røghætte.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering af kontraktilitet, udmattelse og Alternans i isoleret skeletmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluering af muskelfunktionen af ​​extensor digitorum longus musklen<em&gt; Ex vivo</em&gt; Og tibialis anterior muskel<em&gt; In situ</em&gt; I Mus

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering af Myospheres Fra hESCs ved Epigenetisk Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -inducerede nethindedegeneration og Regeneration i zebrafisk: Histologisk og funktionelle egenskaber

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Påvisning af vævs residente bakterier i blære biopsier ved 16S rRNA fluorescens in situ-hybridisering

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Isolering myofibrils fra skeletmuskulatur biopsier og bestemmelse kontraktile funktion med en Nano-Newton resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering af humane ventrikulære kardiomyocytter fra Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Indsamling af skeletmuskulatur biopsier fra superior rum humane musculus Tibialis forreste til mekanisk evaluering

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Enkelt Myofiber Kultur Assay til vurdering af voksne muskelstamcellefunktionalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...