Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de Association Française contre les Myopathies met het Translamuscle programma. De auteurs bedanken Dr. Perla Reyes-Fernandez en Dr. Matthew Borok voor hun zorgvuldige lezing van het manuscript.

Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse en Europese Gemeenschapswetgeving (licentienummer 11-00010).
1. Tragacanth tandvlees bereiding
<ol><li>Los in een glazen beker 6 g Tragacanth poeder op in 100 mL gedeïoniseerd water. Dek af met folie en laat minstens 3 h. soms handmatig roeren met een metalen spatel als het mengsel snel visceus wordt.</li>
	<li>Laat het Tragacanth mengsel bij 60 °C 's nachts in een waterbad of in de oven. Sluit het bekerglas zorgvuldig af om u...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber necrose is een gemeenschappelijk gevolg van traumatische oefening in normale spieren. Het is goed gecompenseerd door een krachtige regeneratieve capaciteit van de lokale spier voor ouders. Echter, in verschillende spieraandoeningen zoals in MDs, de regeneratieve capaciteit van de satelliet cellen wordt aangetast door chronische myonecrose en overmatige fibrose. Recente bevindingen tonen aan dat spiervezels kunnen sterven door necroptose, een gereguleerde vorm van necrose. Meer in het bijzonder kan de remming van...

Striated skeletspieren bestaan voornamelijk uit spiervezels (myofibers), die verantwoordelijk zijn voor de kenmerkende vrijwillige contractiele functie. Deze cellen zijn multinucleated, post-mitotische structuren die mechanische stress die optreedt tijdens de contractie ondersteunen. Structurele stabiliteit van het myofiber membraan (sarcolemma) en de extracellulaire matrix zijn cruciaal voor weefselhomeostase. Satelliet cellen bestaan uit de belangrijkste spier voorloper populatie in volwassen skeletspieren en bestaan in een rusttoestand in gezonde spieren. Na de dood van myofiber wordt de spier regeneratie ondersteund door satelliet cellen na een myogeen programma dat satellietcel activatie, proliferatie, differentiatie en fusie inhoudt om uiteindelijk nieuwe meerkernige myovezels te vormen.
Myofiber ondergang kan optreden in meerdere spieraandoeningen, met inbegrip van mechanisch trauma, ischemie-reperfusie verwondingen, of spier dystrofieën, en het wordt geassocieerd met de necrotische morfologie van dode cellen1,2. Necrotische dood wordt gekenmerkt door de snelle permeabiliteit van het plasma membraan en het vrijkomen van celinhoud in het extracellulaire compartiment3. Het kan voortvloeien uit een niet-gereglementeerde proces waarbij geen goede cel signalering (dat wil zeggen, toevallige necrose), of een georkestreerde intracellulaire traject (dat wil zeggen, gereguleerde necrose). In myofibers, zowel gereguleerde4 en niet-gereglementeerde5 processen kunnen leiden tot necrose. Een typisch gevolg van myonecrose is het vrijkomen van schade-geassocieerde molecuul patronen, het activeren van een krachtige ontstekingsreactie6. De aanwezigheid van macrofagen wordt waargenomen bij ongeveer 48 uur en 72 h na letsel7. Naast hun rol in de klaring van necrotisch puin, zijn ze ook belangrijk in de spier regeneratie van8,9.
Musculaire dystrofieën (MDs) zijn een heterogene groep van pathologieën die vaak het gevolg zijn van een defect in de sarcolemma-structuur. Duchenne spierdystrofie (DMD) is een juveniele X-gebonden ziekte van ongeveer 1 op elke 3.500 mannelijke geboorten wereldwijd10, en wordt veroorzaakt door de afwezigheid van Dystrofine expressie bij de sarcolemma. Chronische degeneratie van het spierweefsel in DMD jongens leidt tot extreme spierzwakte en vroege sterfte. Ontsteking als gevolg van necrotische dood verbetert de cytotoxiciteit, en bevordert spier fibrose en het verlies van spierfunctie11,12. Behandelingen die momenteel in klinische studies gericht zijn op de wortels van spier degeneratieve aandoeningen, zoals gentherapie, worden verwacht om myonecrose te verlichten. Daarom zijn eenvoudige technieken nodig om spier degeneratie nauwkeurig te kwantificeren.
Verschillende methoden worden routinematig gebruikt voor het bewaken van myofiber verlies in vivo. De meting van de enzymatische activiteit van creatine kinase (CK) in het bloed maakt een betrouwbare kwantificering van aanhoudende necrose in spier-en hart weefsels mogelijk. In situ is de kleuring van bij en eosine (H & E) de meest populaire methode die momenteel wordt gebruikt voor de diagnose om de remodelleer van degeneratie-regeneratie te beoordelen. De moleculaire basis van de H & E-etikettering van dode cellen blijft echter onduidelijk. Bovendien zijn kleurwijzigingen die suggereren dat de dood van myofiber in H & E-kleuring relatief subtiel is en niet betrouwbaar en reproduceerbare kwantificering vergemakkelijken. Methoden die DNA-fragmentatie onthullen, zoals de terminale deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick end labelling (TUNEL), onvolkomen label necrotische dood3. Ze zijn ook slecht aangepast om de dood van syncytiële cellen zoals myofibers te monitoren. De injectie van vitale kleurstoffen, zoals Evan's Blue Dye (EBD), vertegenwoordigt een nuttig alternatief voor het beoordelen van myovezels die de integriteit van sarcolemma hebben verloren, maar is niet noodzakelijkerwijs handig in sommige experimentele protocollen. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van EBD in bloedmonsters kan invloed hebben op de resultaten van CK metingen, een colorimetrische assay. Bovendien maakt intracellulaire opname van EBD co-immunolabeling uitdagend. Daarom is een alternatieve methode voor directe etikettering van myofibers die necrose ondergaat van belang.
Het werkingsmechanisme van vitale kleurstoffen berust op het verlies van de integriteit van het plasma membraan in necrotische myovezels en de passieve opname van de geïnjecteerde kleurstof. Evenzo, necrotische myofibers opname bloed eiwitten zoals albumine, waarvoor EBD heeft een sterke affiniteit13,14, immunoglobuline G (IgG), en IgM15. De abnormale aanwezigheid van bloed eiwitten binnen myovezels vertegenwoordigt daarom handige markers voor myonecrose in situ. Kleuring deze eiwitten kunnen een alternatief zijn voor het gebruik van vitale kleurstoffen.
Door gebruik te maken van IgG-opname als een marker van myonecrose in situ, wordt dit protocol gebruikt om de spier degeneratie in de tibialis voorste (TA) van de MDX-Dystrofine-deficiënte muizen te beoordelen. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve technieken: 1) het is reproduceerbaar en eenvoudig in de uitvoering ervan; 2) het vereist geen dier behandeling voorafgaand aan de spier inzameling, zoals de injectie van circulerende vitale kleurstoffen, en 3) als elke conventionele immunolabeling, het is compatibel met co-labeling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

De necrose van spiervezels (myonecrose) speelt een centrale rol in de pathogenese van verschillende spieraandoeningen, waaronder spier dystrofieën. Therapeutische opties aanpakken van de oorzaken van spierdystrofie pathogenese worden verwacht te verlichten spier degeneratie. Daarom is een methode nodig om de mate van celdood in spier biopsieën te testen en te kwantificeren. Conventionele methoden om myofiber degeneratie in situ te observeren zijn ofwel slecht kwantitatief of vertrouwen op de injectie van vitale kleurstoffen. In dit artikel wordt een immunofluorescentie protocol beschreven dat necrotische myovezels vlekken door de opname van immunoglobuline G (IgG) door myovezels te targeten. De IgG-opnamemethode is gebaseerd op celkenmerken die de necrotische ondergang karakteriseren, waaronder 1) het verlies van de integriteit van het plasma membraan met de afgifte van schade-geassocieerde moleculaire patronen en 2) de opname van plasmatische eiwitten. De co-immuunetikettering van myovezels, extracellulaire matrix proteïnen en muis IgG maakt een heldere en eenvoudige identificatie van myovezels met necrotisch lot mogelijk. Deze eenvoudige methode is geschikt voor kwantitatieve analyse en toepasbaar op alle soorten, inclusief menselijke monsters, en vereist geen injectie van vitale kleurstof. De kleuring van necrotische myovezels door IgG-opname kan ook worden gekoppeld aan andere co-immunolabeling.

Myovezels worden omgeven door een lamininebevattende extracellulaire matrix. Rode kleuring bebaand de myofibers periferie en maakt identificatie mogelijk. IgG wordt groen weergegeven. Nuclei zijn gekleurd met DAPI en worden blauw gevonden onder de Microscoop. Kernen worden hier echter in wit getoond (Figuur 1). Een zwakke IgG-immunoreactiviteit wordt verwacht in het extracellulaire compartiment, dat kan worden verhoogd in geval van ontsteking. Groene kleuring...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.

Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Myofiber necrose is kenmerkend voor meerdere neuromusculaire aandoeningen en speelt een centrale rol bij pathogenese. Een specifieke, betrouwbare methode voor het beoordelen van spierdegeneratie is belangrijk voor diagnose en translationeel onderzoek. Deze uiterst aanpasbare techniek maakt het mogelijk om meerdere antigeens als dezelfde tijd in dezelfde sectie binnen die myofibers te labelen.Het is mogelijk met vitale kleurstoffen. H&E kleuring is een empirische methode die niet aanpasbaar is voor betrouwbare en reproduceerbare vervoeging. IgG opname kleuring, echter, is specifiek voor necrotische spiercellen en van toepassing op menselijke biopten.Deze techniek kan inzicht geven in alle neuromusculaire aandoeningen die worden gekenmerkt door myonecrose. Na het verwijderen van het haar uit het been van belang plaats de vier weken oude mannelijke mdx dier in de supine positie en zet de poten aan een kurk boord. Met behulp van precisie schaar of tang verwijder de beenhuid van de voet naar de knie om de gehele lengte van het scheenbeen en tibialis voorste bloot te stellen.Gebruik de schaar om een incisie te maken tussen het scheenbeen en de tibialis anterior. Gebruik tangen om de epimysiumlaag voorzichtig van het oppervlak van de spier te verwijderen. Bij de enkel, gebruik maken van de tangen om de tibialis voorste pees te isoleren van de andere pezen en voorzichtig optrekken op de pees te isoleren van het scheenbeen en de omliggende spieren.Wanneer de tibialis voorste buik volledig gescheiden heeft houd de pees omhoog, zodat alleen het proximale deel van de tibialis voorste spier is bevestigd aan de knie. En verdef voorzichtig de proximale pees zo dicht mogelijk bij de knieschijf. Plaats de tibialis voorste op een stuk gaas licht gedempt met zoutoplossing om te voorkomen dat drogen.Gedeeltelijk dompel een beker met 70 tot 100 milliliter isopentane in een container met vloeibare stikstof totdat de isopentane aan de onderkant van het bekerglas een witte vaste stof wordt. Zorgvuldig pre-label de andere kant van de kurken, zodat de biopsie goed kan worden geïdentificeerd na het invriezen, en voeg ongeveer 0,5 milliliter tragacanth gom op een 20 bij 11 bij 8 millimeter cirkelvormig stuk kurk. Gebruik tangen om de tibialis voorste insluiten in het tandvlees distale pees kant omhoog.Houd de spier met zijn as loodrecht op het kurkoppervlak. Ten minste de helft van de pees kant van de tibialis voorste moet onbedekt blijven door het tandvlees. Dan snel dip de kurk met de ingebedde spier in de gekoelde, niet bevroren isopentane voor ongeveer twee minuten om volledige bevriezing mogelijk te maken.Verkrijg delen van het bevroren weefsel, stel de cryostattemperatuur in op min 25 graden Celsius en gebruik een optimale snijtemperatuurverbinding om het weefsel op het cryostat-snijblok te bevestigen. Trim het monster tot de spierbuik is bereikt. Verkrijg zeven tot tien micrometersecties die ten minste twee secties per glazen schuif verzamelen, waarbij de glijbanen op kamertemperatuur worden gebracht terwijl de secties worden vastgelegd.Laat de weefsels minstens 20 minuten drogen bij kamertemperatuur in een geventileerde omgeving. Bewaar het gedeelte dan op min 80 graden Celsius tot ze vlekken hebben. Immunolabel van de weefsels.Ontdooi eerst de glijbanen op kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten in de geventileerde omgeving. Vervolgens de afbakenen van de secties met een hydrofobe pen. Bevestig de weefsels met 2%paraformaldehyde gedurende 10 minuten in een vochtige kamer.Spoel aan het einde van een fixatie de secties af met twee wasbeurten van 5 minuten in verse PBS per wasbeurt. Blokkeer elke niet-specifieke binding met 10% geitenserum verdund in PBS. Na 1 uur bij kamertemperatuur labelen de secties met een primaire antistoffen van belang, verdund in 5%geitenserum gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, spoel de dia's met drie 5 minuten wasbeurten in PBS volgen door etikettering met de juiste fluorofofoforische geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie was je de glijbanen met drie wasbeurten van 10 minuten in PBS. Monteer de sectie met een fluorescerend montagemedium met 100 nanogram per milliliter DAPI en een afdeksel.Droog vervolgens de glijbanen 's nachts op vier graden Celsius voordat beeldvorming. Tibialis voorste spieren van vier weken oude mdx muizen vertonen vaak heterogene profielen, waaronder slecht aangetaste gebieden in degraderende en regenererende gebieden samen in dezelfde dwarsdoorsnede. Onaangetast tot licht aangetaste spiergebieden bevatten myofibers van een grote en homogene grootte en kernen met een lage dichtheid die zich voornamelijk aan de periferie of tussen myofibers bevinden.IgG positieve myofibers zijn over het algemeen afwezig in dergelijke gezondheids- of licht getroffen gebieden, terwijl IgG-immunoreactiviteit binnen de myofibers myonecrosis aangeeft. Nieuw gevormde myofibers zijn aanwezig in een kleine omvang in hun vroege stadia van regeneratie geleidelijk vergroten als de spierverervers zekering in bijdragen aan de syncytiele cel. Tijdens dit proces blijft de myonuclei in het centrum van het regenererende weefsel met clusters van kleine, centraal nucleated myofibers die onlangs geregenereerde myofibers aangeven Om het risico op artefacten te minimaliseren is het belangrijk om in de spieren recht te houden bij het bevriezen van het weefsel en bij de juiste temperatuur.Isopentane en PFA moeten altijd voorzichtig en onder een rookkap worden behandeld.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Voorbereiding en gebruiken Phantom Letsels aan Fine Needle Aspiration Biopten Practice

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; En Voorste scheenbeenspier Spier<em&gt; In situ</em&gt; In Muizen

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methyl- (MNU) geïnduceerde retinale degeneratie en regeneratie in de zebravis: histologische en functionele kenmerken

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...