Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par l'Association Française contre les Myopathies avec le programme Translamuscle. Les auteurs remercient le Dr Perla Reyes-Fernandez et le Dr Matthew Borok pour leur lecture attentive du manuscrit.

Les expériences ont été menées conformément à la législation Français et communautaire européenne (numéro de licence 11-00010).
1. Préparation de gomme de Tragacanth
<ol><li>Dans un bécher en verre, dissoudre 6 g de poudre de tragacanth dans 100 ml d'eau déionisée. Couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer au moins 3 h. Parfois, remuer manuellement à l''œil d'une spatule métallique au fur et à mesure que le mélange devient visqueux.</li>
	<li>Laisser le mélange de ...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

La nécrose de myofiber est une conséquence commune de l'exercice traumatique dans les muscles normaux. Il est bien compensé par une puissante capacité régénératrice des ancêtres musculaires locaux. Cependant, dans plusieurs conditions musculaires telles que dans les MD, la capacité régénératrice des cellules satellites est compromise par la myonécrose chronique et la fibrose excessive. Des résultats récents montrent que les fibres musculaires peuvent mourir par nécroptose, une forme réglementée de nécr...

Le muscle squelettique strié se compose principalement de fibres musculaires (myofibers), qui sont responsables de la fonction contractuelle volontaire caractéristique. Ces cellules sont des structures post-mitotiques multinuclées qui soutiennent le stress mécanique pendant la contraction. La stabilité structurale de la membrane de myofiber (sarcolemma) et de sa matrice extracellulaire sont cruciales pour l'homéostasie de tissu. Les cellules satellites constituent la population principale d'ancêtres musculaires dans le muscle squelettique mature et existent dans un état quiescent dans les muscles sains. Après la mort de myofiber, la régénération de muscle est soutenue par des cellules satellites suivant un programme myogenic qui implique l'activation de cellules de satellite, la prolifération, la différenciation, et la fusion pour former en fin de compte de nouveaux myofibers multinucleateds.
La disparition de myofiber peut se produire dans les conditions musculaires multiples, y compris le trauma mécanique, les dommages de ischémie-reperfusion, ou les dystrophies musculaires, et elle est associée à la morphologie nécrotique des cellules mortes1,2. La mort nécrotique se caractérise par la perméabilité rapide de la membrane plasmatique et la libération de contenu cellulaire dans le compartiment extracellulaire3. Elle peut résulter soit d'un processus non réglementé impliquant aucune signalisation cellulaire appropriée (c.-à-d. nécrose accidentelle), soit d'une voie intracellulaire orchestrée (c.-à-d. nécrose réglementée). Dans les myofibers, les processus réglementés4 et non réglementés5 peuvent conduire à la nécrose. Une conséquence typique de la myonécrose est la libération de modèles de molécules associés aux dommages, activant une réponse inflammatoire puissante6. La présence de macrophages est observée à environ 48 h et 72 h après une blessure7. Outre leur rôle dans le déblaiement des débris nécrotiques, ils sont également importants dans la régénération musculaire8,9.
Les dystrophies musculaires (MD) sont un groupe hétérogène de pathologies qui résultent souvent d'un défaut dans la structure de sarcolemma. La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie juvénile liée à l'X qui touche environ 1 naissance masculine sur 3 500 dans le monde10,et elle est causée par l'absence d'expression de la dystrophine au sarcolemma. La dégénérescence chronique du tissu musculaire chez les garçons DMD conduit à une faiblesse musculaire extrême et la mortalité précoce. L'inflammation résultant de la mort nécrotique améliore la cytotoxicité, et favorise la fibrose musculaire et la perte de la fonction musculaire11,12. Les traitements actuellement en essais cliniques ciblant les racines des troubles dégénératifs musculaires, tels que la thérapie génique, devraient soulager la myonécrose. Des techniques simples pour quantifier avec précision la dégénérescence musculaire sont donc nécessaires.
Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour surveiller la perte de myofibre in vivo. La mesure de l'activité enzymatique de la créatine kinase (CK) dans le sang permet une quantification fiable de la nécrose continue dans les tissus musculaires et cardiaques. In situ, la coloration de l'hématoxylin et de l'éosine est la méthode la plus populaire actuellement utilisée dans le diagnostic pour évaluer le remodelage dégénérescence-régénération. Cependant, la base moléculaire de l'étiquetage des cellules mortes de h et E demeure incertaine. En outre, les modifications de couleur suggérant la mort de myofiber dans la coloration de H et E sont relativement subtiles et ne facilitent pas la quantification fiable et reproductible. Méthodes révélant la fragmentation de l'ADN, comme le terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end label (TUNEL), imparfaitement étiquette mort nécrotique3. Ils sont également mal adaptés pour surveiller la mort des cellules syncytiales telles que les myofibres. L'injection de colorants vitaux, comme le colorant bleu d'Evan (DME), représente une alternative utile pour évaluer les myofibres qui ont perdu l'intégrité du sarcolamme, mais n'est pas nécessairement pratique dans certains protocoles expérimentaux. Par exemple, la présence d'EBD dans les échantillons de sang peut affecter les résultats des mesures de CK, un test coloriable. En outre, l'utilisation intracellulaire de l'EBD rend la co-immunoétiquetage difficile. Par conséquent, une méthode alternative permettant l'étiquetage direct des myofibres subissant une nécrose est intéressante.
Le mécanisme d'action des colorants vitaux repose sur la perte de l'intégrité de la membrane plasmatique dans les myofibres nécrotiques et l'apport passif du colorant injecté. De même, les myofibres nécrotiques préservent les protéines sanguines telles que l'albumine, pour laquelle l'EBD a une forte affinité13,14, immunoglobuline G (IgG), et IgM15. La présence anormale de protéines sanguines dans les myofibres représente donc des marqueurs pratiques pour la myonécrose in situ. La coloration de ces protéines peut être une alternative pour l'utilisation de colorants vitaux.
En utilisant l'utilisation d'igG comme marqueur de myonecrosis in situ, ce protocole est employé pour évaluer la dégénérescence de muscle dans le tibialis antérieur (TA) des souris dystrophine-déficientes de mdx. Cette méthode présente des avantages significatifs par rapport aux techniques alternatives : 1) elle est reproductible et simple dans son exécution ; 2) il ne nécessite aucun traitement animal avant la collecte de muscle, tel que l'injection des colorants vitaux circulants, et 3) comme n'importe quel immunoétiquetage conventionnel, il est compatible avec le co-étiquetage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

La nécrose des fibres musculaires (myonécrose) joue un rôle central dans la pathogénie de plusieurs affections musculaires, y compris les dystrophies musculaires. On s'attend à ce que les options thérapeutiques s'attaquant aux causes de la pathogénie de dystrophie musculaire soulagent la dégénérescence de muscle. Par conséquent, une méthode pour évaluer et quantifier l'étendue de la mort cellulaire dans les biopsies musculaires est nécessaire. Les méthodes conventionnelles pour observer la dégénérescence myofibre in situ sont soit mal quantitatives, soit reposent sur l'injection de colorants vitaux. Dans cet article, un protocole d'immunofluorescence est décrit qui tache les myofibers nécrotiques en ciblant l'adoption d'immunoglobuline G (IgG) par myofibers. La méthode d'utilisation d'IgG est basée sur des dispositifs cellulaires caractérisant la disparition nécrotique, y compris 1) la perte de l'intégrité de membrane de plasma avec la libération des modèles moléculaires dommages-associés et 2) l'utilisation des protéines plasmatiques. Dans les coupes murines, la co-immunoétiquetage des myofibres, des protéines de matrice extracellulaire et de la souris IgG permet d'identifier proprement et simplement les myofibres avec le destin nécrotique. Cette méthode simple convient à l'analyse quantitative et s'applique à toutes les espèces, y compris les échantillons humains, et ne nécessite pas l'injection de colorant vital. La coloration des myofibres nécrotiques par l'utilisation d'IgG peut également être jumelée à d'autres co-immunoétiquetage.

Les myofibres sont entourées d'une matrice extracellulaire contenant de la laminin. La coloration rouge délimite la périphérie des myofibres et permet leur identification. IgG est affiché en vert. Les noyaux sont tachés de DAPI et se trouvent en bleu sous le microscope. Cependant, les noyaux sont représentés en blanc ici (Figure 1). Une faible immunoréactivité IgG est prévue dans le compartiment extracellulaire, qui peut être augmenté en cas d'in...

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Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Décrit ici est un protocole pour l'immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l'immunoglobuline G (IgG). Révéler l'apport d'IgG par les myofibres permet l'identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l'état musculaire.

Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

La nécrose myofiber est caractéristique des désordres neuromusculaires multiples et joue un rôle central dans la pathogénie. Une méthode spécifique et fiable pour évaluer la dégénérescence musculaire est importante pour le diagnostic et la recherche translationnelle. Cette technique extrêmement adaptable permet l’étiquetage de l’antigène multiple en même temps dans la même section à l’intérieur de ce myofibers.Il est possible avec des dyes vitales. La coloration H&E est une méthode empirique qui n’est pas adaptable à une conjugaison fiable et reproductible. La coloration d’absorption d’IgG, cependant, est spécifique pour des cellules de muscle nécrotiques et applicable aux biopsies humaines.Cette technique peut fournir un aperçu de tous les désordres neuromusculaires caractérisés par la myonecrose. Après avoir enlevé les cheveux de la jambe d’intérêt placer l’animal mdx mâle de quatre semaines dans la position supine et fixer les pattes à un panneau de liège. À l’aide de ciseaux ou de forceps de précision, retirez la peau de la jambe du pied au genou pour exposer toute la longueur du tibia et du tibialis antérieur.Utilisez les ciseaux pour faire une incision entre le tibia et le tibialis antérieur. Utilisez des forceps pour enlever soigneusement la couche d’épimysium de la surface du muscle. À la cheville, utilisez les forceps pour isoler le tendon antérieur tibialis des autres tendons et tirez doucement vers le haut sur le tendon pour l’isoler du tibia et des muscles environnants.Lorsque le ventre antérieur tibialis a entièrement séparé tenir le tendon vers le haut de sorte que seule la partie proximale du muscle antérieur tibialis est attaché au genou. Et couper doucement le tendon proximal aussi près que possible de la rotule. Placez le tibialis antérieur sur un morceau de gaze légèrement amorti avec de la solution saline pour éviter le séchage.Tremper partiellement un bécher contenant de 70 à 100 millilitres d’isopentane dans un récipient d’azote liquide jusqu’à ce que l’isopentane au fond du bécher devienne un solide blanc. Pré-étiqueter soigneusement l’autre côté des bouchons afin que la biopsie puisse être correctement identifiée après congélation, et ajouter environ 0,5 millilitres de gomme de tragacanth sur un morceau circulaire de liège de 20 x 11 par 8 millimètres. Utilisez des forceps pour intégrer l’antérieur tibialis dans le côté du tendon distal de la gencive vers le haut.Tenir le muscle avec son axe perpendiculaire à la surface du liège. Au moins la moitié du côté tendin de l’antérieur tibialis doit rester découvert par la gencive. Puis trempez rapidement le liège avec le muscle incorporé dans l’isopentane réfrigéré et non congelé pendant environ deux minutes pour permettre une congélation complète.Obtenez des sections du tissu congelé, réglez la température du cryostat à moins 25 degrés Celsius et utilisez le composé optimal de température de coupe pour fixer le tissu sur le bloc de coupe cryostatique. Couper l’échantillon jusqu’à ce que le ventre musculaire soit atteint. Obtenez sept à dix sections de micromètres recueillant au moins deux sections par glissière de verre plaçant les glissières à température ambiante au fur et à mesure que les sections sont capturées.Laissez sécher les tissus pendant au moins 20 minutes à température ambiante dans un environnement ventilé. Ensuite, stockez la section à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils tachent. Immunolabel les tissus.Tout d’abord, décongeler les glissières à température ambiante pendant au moins 15 minutes dans l’environnement ventilé. Ensuite, délimité les sections avec un stylo hydrophobe. Fixer les tissus avec 2% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes dans une chambre humide.À la fin d’une fixation rincer les sections avec deux lavages de 5 minutes en PBS frais par lavage. Bloquez toute liaison non spécifique avec 10% sérum de chèvre dilué dans PBS. Après 1 heure à température ambiante étiqueter les sections avec un anticorps primaire d’intérêt, dilué dans 5% sérum de chèvre pendant 2 heures à température ambiante.À la fin de l’incubation, rincer les glissières avec trois lavages de 5 minutes dans PBS suivre en étiquetant avec le fluorophore approprié conjugué anticorps secondaires pendant 45 minutes à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les toboggans avec trois lavages de 10 minutes en PBS. Montez la section avec un support fluorescent contenant 100 nanogrammes par millilitre de DAPI et un glissement de couverture.Ensuite, séchez les glissières pendant la nuit à quatre degrés Celsius avant l’imagerie. Les muscles antérieurs Tibialis des souris mdx âgées de quatre semaines présentent souvent des profils hétérogènes, y compris des zones mal affectées dans les zones dégénérantes et régénérantes ensemble dans la même section transversale. Les zones musculaires peu affectées contiennent des myofibers de grande taille et homogènes et des noyaux à faible densité qui sont principalement situés à la périphérie ou entre les myofibers.Les myofibers positifs d’IgG sont généralement absents dans de telles régions de santé ou légèrement affectées tandis que l’immunoréactivité d’IgG dans les myofibers indique myonecrosis. Les myofibers nouvellement formés sont présents à une petite taille à leurs premiers stades de régénération s’agrandissant progressivement pendant que les progéniteurs de muscle fusionnent dans contribuent à la cellule syncytial. Au cours de ce processus, les myonucléi restent au centre du tissu régénérant avec des grappes de petits myofibers centralement nucléés indiquant myofibers récemment régénérés Pour minimiser le risque d’artefacts, il est important de garder dans les muscles droits lors de la congélation du tissu et à la bonne température.L’isopentane et le PFA doivent toujours être manipulés avec prudence et sous un capot de fumée.

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