Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von der Association Franéaise contre les Myopathies mit dem Translamuscle-Programm unterstützt. Die Autoren danken Dr. Perla Reyes-Fernandez und Dr. Matthew Borok für die sorgfältige Lektüre des Manuskripts.

Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit den französischen und europäischen Rechtsvorschriften (Lizenznummer 11-00010) durchgeführt.
1. Tragacanth-Kaugummi-Präparat
<ol><li>In einem Glasbecher 6 g Tragacanthpulver in 100 ml entionisiertem Wasser auflösen. Mit Folie abdecken und mindestens 3 h ablassen. Gelegentlich manuell mit einem Metallspachtel rühren, wenn die Mischung schnell zähflüssig wird.</li>
	<li>Lassen Sie die Tragacanth-Mischung bei 60 °C über Nacht im Wasserbad ode...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber-Nekrose ist eine häufige Folge traumatischer Bewegung in normalen Muskeln. Es wird durch eine starke Regenerationsfähigkeit der lokalen Muskelvorläufer gut kompensiert. Bei mehreren Muskelerkrankungen, wie z. B. bei MDs, wird die Regenerationsfähigkeit von Satellitenzellen jedoch durch chronische Myonekrose und übermäßige Fibrose beeinträchtigt. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Muskelfasern durch Nekkrotose, eine regulierte Form der Nekrose, absterben können. Genauer gesagt, die Hemmung der Nekrotose ka...

Gestreifter Skelettmuskel besteht hauptsächlich aus Muskelfasern (Myofiber), die für die charakteristische freiwillige kontraktile Funktion verantwortlich sind. Diese Zellen sind multinukleierte, post-mitotische Strukturen, die mechanische Beanspruchung unterstützen, die während der Kontraktion auftritt. Die strukturelle Stabilität der Myofibermembran (Sarcolemma) und ihrer extrazellulären Matrix sind entscheidend für die Gewebehomöostase. Satellitenzellen bilden die Hauptmuskelvorläuferpopulation in reifen Skelettmuskeln und existieren in einem ruhestillen Zustand in gesunden Muskeln. Nach dem Myofibertod wird die Muskelregeneration von Satellitenzellen nach einem myogenen Programm unterstützt, das die Aktivierung, Proliferation, Differenzierung und Fusion von Satellitenzellen umfasst, um schließlich neue multinukleierte Myofiber zu bilden.
Myofiber-Tod kann bei mehreren Muskelerkrankungen auftreten, einschließlich mechanischer Traumata, Ischämie-Reperfusionsverletzungen oder Muskeldystrophien, und es ist mit der nekrotischen Morphologie der abgestorbenen Zellen1,2verbunden. Der nekrotische Tod ist durch die schnelle Durchlässigkeit der Plasmamembran und die Freisetzung des Zellgehalts im extrazellulären Fach3gekennzeichnet. Es kann entweder aus einem unregulierten Prozess ohne richtige Zellsignalisierung (d. h. versehentliche Nekrose) oder einem orchestrierten intrazellulären Weg (d. h. regulierter Nekrose) resultieren. Bei Myofiberen können sowohl geregelte4 als auch unregulierte5 Prozesse zu Nekrose führen. Eine typische Folge der Myonekinismus ist die Freisetzung von schadensassoziierten Molekülmustern, die eine starke Entzündungsreaktion aktivieren6. Das Vorhandensein von Makrophagen wird bei etwa 48 h und 72 h nach Verletzung7beobachtet. Neben ihrer Rolle bei der Clearance von nekrotischen Ablagerungen sind sie auch wichtig bei der Muskelregeneration8,9.
Muskeldystrophien (MDs) sind eine heterogene Gruppe von Pathologien, die oft auf einen Defekt in der Sarcolemma-Struktur zurückzuführen sind. Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) ist eine juvenile X-verknüpfte Krankheit, die etwa 1 von 3.500 männlichen Geburten weltweit10betrifft, und sie wird durch das Fehlen von Dystrophin-Expression am Sarcolemma verursacht. Chronische Degeneration des Muskelgewebes bei DMD-Jungen führt zu extremer Muskelschwäche und früher Sterblichkeit. Entzündungen, die durch den nekrotischen Tod entstehen, verbessern die Zytotoxizität und fördern die Muskelfibrose und den Verlust der Muskelfunktion11,12. Behandlungen, die sich derzeit in klinischen Studien mit den Wurzeln von Muskeldegenerativen Erkrankungen, wie gentherapie, richten, sollen die Myonekinz lindern. Daher sind einfache Techniken zur genauen Quantifizierung der Muskeldegeneration erforderlich.
Mehrere Methoden werden routinemäßig verwendet, um Myofiber Verlust in vivo zu überwachen. Die Messung der enzymatischen Aktivität der Kreatinkinase (CK) im Blut ermöglicht eine zuverlässige Quantifizierung der fortlaufenden Nekrose in Muskel- und Herzgeweben. In situ ist die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) die beliebteste Methode, die derzeit in der Diagnose zur Beurteilung der Degeneration-Regenerations-Remodellierung verwendet wird. Die molekulare Grundlage der H&E-Kennzeichnung abgestorbener Zellen bleibt jedoch unklar. Darüber hinaus sind Farbmodifikationen, die auf den Myofibertod bei der H&E-Färbung hindeuten, relativ subtil und ermöglichen keine zuverlässige und reproduzierbare Quantifizierung. Methoden, die DNA-Fragmentierung offenbaren, wie die Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase dUTP-Nick-End-Etikettierung (TUNEL), unvollkommen kennzeichnen nekrotischen Tod3. Sie sind auch schlecht angepasst, um den Tod von Synzytialzellen wie Myofibers zu überwachen. Die Injektion von Vitalfarbstoffen, wie Evans Blaufarbstoff (EBD), stellt eine nützliche Alternative zur Beurteilung von Myofiwanen dar, die die Integrität von Sarcolemma verloren haben, aber in einigen experimentellen Protokollen nicht unbedingt bequem sind. Zum Beispiel kann das Vorhandensein von EBD in Blutproben die Ergebnisse von CK-Messungen beeinflussen, ein kolorimetrischer Test. Darüber hinaus stellt die intrazelluläre Aufnahme von EBD die Co-Immunolabelling-Herausforderung dar. Daher ist eine alternative Methode, die eine direkte Kennzeichnung von Myofiberen ermöglicht, die sich einer Nekrose unterziehen, von Interesse.
Der Wirkmechanismus lebenswichtiger Farbstoffe beruht auf dem Verlust der Plasmamembranintegrität bei nekrotischen Myofikern und der passiven Aufnahme des injizierten Farbstoffs. In ähnlicher Weise nehmen nekrotische Myofiber Blutproteine wie Albumin auf, für die EBD eine starke Affinität hat13,14, Immunglobulin G (IgG) und IgM15. Das abnormale Vorhandensein von Blutproteinen in Myofiberstelltstelltstelltstellt daher praktische Marker für Myonecrosis vor Ort. Die Färbung dieser Proteine kann eine Alternative für die Verwendung von lebenswichtigen Farbstoffen sein.
Durch die Verwendung der IgG-Aufnahme als Marker der Myonekinkis in situ wird dieses Protokoll verwendet, um die Muskeldegeneration im tibialis anterior (TA) von mdx Dystrophin-mangelhaften Mäusen zu bewerten. Diese Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber alternativen Techniken: 1) sie ist reproduzierbar und einfach in ihrer Ausführung; 2) es erfordert keine Tierbehandlung vor der Muskelentnahme, wie die Injektion von zirkulierenden Vitalfarbstoffen, und 3) wie jede herkömmliche Immunolabelling, ist es mit der Ko-Kennzeichnung kompatibel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Die Nekrose der Muskelfasern (Myonecrosis) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese mehrerer Muskelerkrankungen, einschließlich Muskeldystrophien. Therapeutische Optionen zur Bekämpfung der Ursachen der Muskeldystrophie Pathogenese werden erwartet, um Muskeldegeneration zu lindern. Daher ist eine Methode erforderlich, um das Ausmaß des Zelltodes in Muskelbiopsien zu asse- und zu quantifizieren. Herkömmliche Methoden zur Beobachtung der Myofiberdegeneration vor Ort sind entweder schlecht quantitativ oder verlassen sich auf die Injektion lebenswichtiger Farbstoffe. In diesem Artikel wird ein Immunfluoreszenzprotokoll beschrieben, das nekrotische Myofiber durch gezielte Immunglobulin-G-Aufnahme (IgG) durch Myofiber stutzt. Die IgG-Aufnahmemethode basiert auf Zellmerkmalen, die den nekrotischen Untergang charakterisieren, einschließlich 1) des Verlusts der Plasmamembranintegrität mit der Freisetzung von schadensassoziierten molekularen Mustern und 2) der Aufnahme von Plasmaproteinen. In murinen Querschnitten ermöglicht die Co-Immunolabelling von Myofibiden, extrazellulären Matrixproteinen und Maus-IgG eine saubere und unkomplizierte Identifizierung von Myofiberen mit nekrotischem Schicksal. Diese einfache Methode eignet sich für die quantitative Analyse und gilt für alle Arten, einschließlich menschlicher Proben, und erfordert keine Injektion von Vitalfarbstoff. Die Färbung nekrotischer Myofiber durch IgG-Aufnahme kann auch mit anderen Co-Immunolabelling gekoppelt werden.

Myofiber sind von einer lamininhaltigen extrazellulären Matrix umgeben. Rote Färbung begrenzt Myofibers Peripherie und ermöglicht ihre Identifizierung. IgG wird grün dargestellt. Kerne sind mit DAPI gefärbt und finden sich blau unter dem Mikroskop. Allerdings sind Die Kerne hier weiß dargestellt (Abbildung 1). Im extrazellulären Fach wird eine schwache IgG-Immunreaktivität erwartet, die bei Entzündungen erhöht werden kann. Grüne Färbung innerhalb ...

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Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Myofibernekrose ist charakteristisch für mehrere neuromuskuläre Störungen und spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. Eine spezifische, zuverlässige Methode zur Beurteilung der Muskeldegeneration ist wichtig für die Diagnose und translationale Forschung. Diese extrem anpassungsfähige Technik ermöglicht die Gleichzeitige Kennzeichnung von multiplem Antigen im selben Abschnitt innerhalb der Myofiber.Es ist mit lebenswichtigen Farbstoffen möglich. H&E-Färbung ist eine empirische Methode, die für eine zuverlässige und reproduzierbare Konjugation nicht anpassungsfähig ist. IgG-Aufnahmefärbung ist jedoch spezifisch für nekrotische Muskelzellen und gilt für menschliche Biopsien.Diese Technik kann Einblick in alle neuromuskulären Störungen geben, die durch Myonekinkismus gekennzeichnet sind. Nach dem Entfernen der Haare aus dem Bein von Interesse stellen Sie das vier Wochen alte männliche mdx Tier in die Supine-Position und sichern Sie die Pfoten an einem Korkbrett. Mit Präzisionsscheren oder Zangen entfernen Sie die Beinhaut vom Fuß bis zum Knie, um die gesamte Länge der Tibia und Tibialis vorderzulegen.Verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt zwischen der Tibia und dem tibialis vorder zu machen. Verwenden Sie Zangen, um die Epimysiumschicht vorsichtig von der Oberfläche des Muskels zu entfernen. Verwenden Sie am Knöchel die Zange, um die tibialis vordere Sehne von den anderen Sehnen zu isolieren und sanft an der Sehne hochzuziehen, um sie von der Tibia und den umliegenden Muskeln zu isolieren.Wenn der tibialis vordere Bauch vollständig abgetrennt ist, halten Sie die Sehne so hoch, dass nur der proximale Teil des tibialis vorderen Muskels am Knie befestigt ist. Und die proximale Sehne so nah wie möglich an der Patella abtrennen. Legen Sie den tibialis vorderauf auf ein Stück Gaze leicht mit Salzmittel gedämpft, um ein Trocknen zu vermeiden.Teilweise tauchen Sie einen Becher mit 70 bis 100 Milliliter Isopentan in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff, bis das Isopentan am Boden des Becherkers zu einem weißen Feststoff wird. Die andere Seite der Korken sorgfältig vorbeschriften, damit die Biopsie nach dem Einfrieren richtig identifiziert werden kann, und etwa 0,5 Milliliter Tragacanth-Kaugummi auf ein 20 mal 11 mal 8 Millimeter großes kreisförmiges Korkstück geben. Verwenden Sie Zangen, um die tibialis vorderin in die Gummi-Distalsehnseite einzubetten.Halten des Muskels mit seiner Achse senkrecht zur Korkoberfläche. Mindestens die Hälfte der Sehnenseite des Tibialis vorderes sollte vom Zahnfleisch freigelegt bleiben. Dann tauchen Sie den Korken mit dem eingebetteten Muskel schnell in das gekühlte, ungefrorene Isopentan für etwa zwei Minuten, um ein vollständiges Einfrieren zu ermöglichen.Erhalten Sie Abschnitte des gefrorenen Gewebes, stellen Sie die Kryostattemperatur auf minus 25 Grad Celsius und verwenden Sie die optimale Schnitttemperaturverbindung, um das Gewebe auf den Kryostat-Schneidblock zu fixieren. Trimmen Sie die Probe, bis der Muskelbauch erreicht ist. Erhalten Sie sieben bis zehn MikrometerAbschnitte, die mindestens zwei Abschnitte pro Glasrutsche sammeln und die Dias bei Raumtemperatur platzieren, während die Abschnitte erfasst werden.Lassen Sie das Gewebe mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur in einer belüfteten Umgebung trocknen. Dann lagern Sie den Abschnitt bei minus 80 Grad Celsius, bis sie färben. Immunolabel der Gewebe.Zuerst die Dias bei Raumtemperatur mindestens 15 Minuten in der belüfteten Umgebung auftauen. Als nächstes die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift ableiten. Fixieren Sie das Gewebe mit 2%Paraformaldehyd für 10 Minuten in einer feuchten Kammer.Am Ende einer Fixierung spülen sie die Abschnitte mit zwei 5-minuten-Waschungen in frischem PBS pro Waschgang. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 10%Ziegenserum in PBS verdünnt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur beschriften Sie die Abschnitte mit einem primären Antikörper von Interesse, verdünnt in 5%Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation spülen Sie die Dias mit drei 5-minütigen Waschungen in PBS, indem Sie die entsprechenden fluorophor konjugierten Sekundärantikörper 45 Minuten lang bei lichtgeschützter Raumtemperatur etikettieren. Waschen Sie die Dias am Ende der Inkubation mit drei 10-minütigen Wäschen in PBS. Montieren Sie den Abschnitt mit einem fluoreszierenden Montagemedium, das 100 Nanogramm pro Milliliter DAPI und einem Abdeckschlupf enthält.Dann trocknen Sie die Dias über Nacht bei vier Grad Celsius vor der Bildgebung. Tibialis vordere Muskeln von vier Wochen alten mdx-Mäusen zeigen oft heterogene Profile, einschließlich schlecht betroffener Bereiche in degenerierenden und regenerierenden Bereichen zusammen im selben Querschnitt. Unbeeinflusst von leicht betroffenen Muskelbereichen enthalten Myofiber von großer und homogener Größe und Kerne mit geringer Dichte, die sich hauptsächlich an der Peripherie oder zwischen Myofiberbefinden befinden.IgG-positive Myofiber fehlen in solchen gesundheitlichen oder leicht betroffenen Bereichen, während IgG-Immunreaktivität innerhalb der Myofiber auf Myonekrose hindeutet. Neu gebildete Myofiber sind in einer kleinen Größe in ihren frühen Stadien der Regeneration nach und nach größer, wie die Muskelvorläufer verschmelzen in beitragzur Synzytialzelle beitragen. Während dieses Prozesses bleiben die Myonukleien im Zentrum des regenerierenden Gewebes mit Clustern von kleinen, zentral nukleierten Myofibern, die auf kürzlich regenerierte Myofiber hinweisen, um das Risiko von Artefakten zu minimieren, ist es wichtig, in den Muskeln gerade zu bleiben, wenn das Gewebe gefriert und bei der richtigen Temperatur.Isopentan und PFA sollten immer mit Vorsicht und unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

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