Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה הצרפתית הMyopathies עם התוכנית Translamuscle. המחברים מודים לד ר פרלה רייס-פרננדז וד ר מתיו בורבוק על הקריאה הזהירה של כתב היד.

הניסויים נערכו בהתאם לחקיקה הצרפתית והאירופית (רישיון מספר 11-00010).
1. הכנת מסטיק טרגלואקנט
<ol><li>בגביע הזכוכית, מתמוסס 6 גר' אבקת tragacanth ב 100 מ ל של מים מוהים. מכסים עם נייר כסף ולהשאיר לפחות 3 h. מדי פעם מערבבים באופן ידני עם מרית מתכת כמו התערובת במהירות הופך צמיגה.</li>
	<li>השאירו את ...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

נמק מיוסיבי הוא תוצאה נפוצה של התעמלות טראומטית בשרירים נורמליים. הוא מפוצה היטב על ידי קיבולת משובי חזקה של ושלתי השריר המקומי. עם זאת, בכמה מצבים שרירים כגון ב MDs, יכולת ההתחדשות של תאי לווין נפגעת על ידי מחלות כרוניות ופיברוזיס מוגזמת. הממצאים האחרונים מראים כי סיבי השריר יכול למות על יד?...

שריר השלד הסטרינטי מורכב בעיקר מסיבי שריר (מיוסיבים), האחראים על התפקוד הרצוני האופייני. תאים אלה הם מבנים שלאחר הmitotic, התומכים בלחץ מכני המתרחשים במהלך התכווצות. יציבות מבנית של קרום מיוסיבי (sarcolemma) ומטריצה החילוץ שלה חיוניים הומאוסטזיס רקמות. תאי לווין מהווים את האוכלוסייה הראשית של שריר השריר בשריר השלד הבוגר וקיים במצב שקט יותר בשרירים בריאים. בעקבות מוות מיוסיבי, התחדשות שרירים נתמכת על ידי תאי לווין בעקבות תוכנית מיוגניים המערבת תא לווין הפעלה, התפשטות, בידול, והיתוך כדי בסופו של דבר הטופס החדש ביותר מיוקלסין סיבים.
מיומות מוות יכול להתרחש בתנאים שרירים מרובים, כולל טראומה מכנית, איסכמיה-reperfusion פציעות, או dystrophies שרירי, והוא משויך הורפולוגיה נקרוטית של תאים מתים1,2. מוות נקרוטי מאופיין חדירות מהירה של קרום הפלזמה ושחרורו של תוכן התא בתא החילוץ3. זה יכול לנבוע מתהליך בלתי מוסדר מעורבים לא האיתות התא הנכון (כלומר, נמק בשוגג), או מסלול תאיים מאורגן (כלומר, נמק מוסדר). ב סיבים מיואלה, הן מוסדרים4 ו לא מוסדר5 תהליכים יכולים להוביל נמק. תוצאה אופיינית של הבוליזיס היא שחרור של דפוסי מולקולה הקשורים נזק, הפעלת תגובה דלקתית רבת עוצמה6. הנוכחות של מקרופאגים הוא נצפתה סביב 48 h ו 72 h לאחר הפציעה7. מלבד תפקידם בסיווג של פסולת נמק, הם חשובים גם התחדשות שרירים8,9.
Dystrophies שרירים (MDs) הם קבוצה הטרוגנית של פתווגיות אשר לעתים קרובות תוצאה של פגם במבנה sarcolemma. ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא מחלה הקשורה לקטינים X המשפיעים על כ 1 מתוך כל 3,500 זכר לידות ברחבי העולם10, וזה נגרם על ידי היעדר הביטוי הדיסטרופין בsarcolemma. ניוון כרוני של רקמת השריר בילדי DMD מוביל לחולשת שרירים קיצונית ותמותה מוקדמת. דלקת כתוצאה ממוות נקרוטי מגביר את הרעילות, ומקדם פיברוזיס שרירים ואובדן של תפקוד השריר11,12. טיפולים כיום בניסויים קליניים מיקוד השורשים של הפרעות ניווניות שרירים, כגון ריפוי גנטי, צפויים להקל על התרופות. טכניקות פשוטות כדי בדיוק לכמת ניוון שרירים הם נדרשים לכן.
מספר שיטות משמשות באופן שגרתי כדי לפקח על אובדן מיוסיבי בvivo. המדידה של הפעילות האנזימטית של קריאטין קינאז (CK) בדם מאפשרת כימות אמין של נמק מתמשך ברקמות השריר והלב. באתרו, haematoxylin ו אאוזין (H & E) כתמים היא השיטה הפופולרית ביותר כיום בשימוש באבחון להעריך ניוון-התחדשות שיפוץ. עם זאת, הבסיס המולקולרי של התוויות H & E של תאים מתים נשאר ברור. יתר על כן, שינויים צבע להציע מוות מיוסיבי ב H & E כתמים הם עדינים יחסית לא להקל על כימות אמין והזדהות. שיטות חשיפת הפיצול DNA, כגון הטרמינל deoxynucleotidyl מעביר dUTP לסיים את התוויות (TUNEL), באופן מושלם התווית נמק מוות3. הם גם מותאמים בצורה גרועה כדי לפקח על מותם של התאים הסינציוניים כגון סיבים מיועם. הזרקה של צבעים חיוניים, כגון הצבע הכחול של אוון (EBD), מייצגת חלופה שימושית להערכת סיבים מיומיים שאיבדו את השלמות של sarcolemma, אבל הוא לא בהכרח נוח בכמה פרוטוקולים ניסיוניים. למשל, הנוכחות של EBD בדגימות דם יכולה להשפיע על תוצאות של מדידות CK, שיטת צביעה במדד. יתר על כן, ספיגת תאיים של EBD הופך שיתוף immunolabelling מאתגרת. לכן, שיטה חלופית המאפשרת תיוג ישיר של סיבים מיוים שעוברים נמק הוא עניין.
המנגנון של פעולה של צבעים חיוניים מסתמך על אובדן של שלמות הממברנה פלזמה ב נמק מיוטיות ואת ספיגת פסיבי של הצבע המוזרק. באופן דומה, נמק מיוכי סיבים לספיגת חלבונים בדם כגון אלבומין, אשר ebd יש זיקה חזקה13,14, אימונוגלובולין G (igg), ו-igg15. הנוכחות החריגה של חלבונים בדם בתוך מיוסיבים ולכן מייצגת סמנים נוחים ליוווליזיס באתרו. צביעת חלבונים אלה יכולה להיות חלופה לשימוש בצבעים חיוניים.
באמצעות ספיגת IgG כסמן של מצוי באתרו, פרוטוקול זה משמש כדי להעריך ניוון שרירים בחלק הקדמי הפיזי (TA) של עכבר mdx הדיסטרופין לקוי. שיטה זו מציגה יתרונות משמעותיים על-פני טכניקות חלופיות: 1) היא מהווה הוצאה לדרך ופשוטה בביצועה; 2) זה לא דורש שום טיפול בעלי חיים לפני איסוף שרירים, כגון הזרקה של במחזור צבעים חיוניים, ו 3) כמו החיסונית המקובלת כל, הוא תואם עם תוויות שכונתיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

נמק של סיבי שריר (מצוי) ממלא תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מספר מצבים שרירים, כולל dystrophies שרירים. האפשרויות הטיפוליות המתייחסות לגורמים שרירי ניוון שרירים צפויים להקל על ניוון שרירים. לכן, שיטה לקיים ולכמת את היקף מוות התאים בביופסיה שרירים נדרשת. שיטות קונבנציונליות להתבונן ניוון מיוכי באתרו הם או כמותיים גרוע או להסתמך על הזרקת של צבעים חיוניים. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence מתואר כי כתמי נמק מיותמים על ידי מיקוד חיסוני G (IgG) ספיגה של סיבים מיומים. שיטת ספיגה IgG מבוססת על תכונות תא המאפיינים את מותו נמק, כולל 1) אובדן של שלמות קרום הפלזמה עם שחרורו של דפוסי נזק מולקולרי הקשורים ו 2) ספיגת חלבונים פלטיים. ב צולבות מוריין סעיפים, שיתוף החיסונית של מיוסים של סיבים מיותאיים, מטריקס חלבונים, ועכבר IgG מאפשר זיהוי נקי וברור של סיבים מיוטיים עם גורל נקרוטי. שיטה פשוטה זו מתאימה לניתוח כמותי וישימה לכל המינים, כולל דגימות אנושיות, ואינה דורשת הזרקה של צבע חיוני. את הצביעת של הסיבים נמק על ידי ספיגת IgG ניתן גם לזווג עם שיתוף החיסונית אחרים.

סיבי מיואלה מוקפים במטריצה מלמיסטית המכילה מלמינציה. כתמים אדומים תוחמת הפריפריה מיוים ומאפשר זיהוי שלהם. IgG מוצג בירוק. גרעינים הם מוכתמים DAPI והם נמצאים כחול מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, גרעינים מוצגים בלבן כאן (איור 1). הפעילות החיסונית החלשה מהווה מצפה בתאי ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

שמתואר כאן הוא פרוטוקול עבור חיסונית ישירה של מיותטיות של מיוכי שרירים סעיפים. התאים הנקרוסטיים הם חדירות לחלבונים בסרום, לרבות חיסוני G (IgG). חשיפת ספיגת IgG על ידי מיותסיבים מאפשר זיהוי וקוונפיקציה של מיותסיבים שעוברים נמק ללא קשר למצב שריר.

אימונוולבלינג מיוכי ניוון שרירים ביופסיות

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

נמק Myofiber אופייני להפרעות נוירומוסקולריות מרובות וממלא תפקיד מרכזי בפתוגנזה. שיטה ספציפית ואמינה להערכת ניוון שרירים חשובה לאבחון ומחקר תרגום. טכניקה זו מאוד הסתגלות מאפשרת תיוג של אנטיגן מרובים כמו באותו זמן באותו קטע בתוך myofibers.זה אפשרי עם צבעים חיוניים. כתמי H&E הם שיטות אמפיריות שלא ניתנות להתאמה להדבקה אמינה ותרבה. כתמי ספיגת IgG, לעומת זאת, הוא ספציפי עבור תאי שריר נמק ישים ביופסיות אנושיות.טכניקה זו יכולה לספק תובנה לתוך כל הפרעות neuromuscular מאופיין myonecrosis. לאחר הסרת השיער מהרגל של עניין מקום חיית mdx זכר בן ארבעה שבועות בתצב supine ולאבטח את הכפות ללוח שעם. באמצעות מספריים מדויקים או ממטרות להסיר את עור הרגל מהרגל אל הברך כדי לחשוף את כל אורך השוקה ו tibialis anterior.השתמש במספריים כדי להפוך חתך בין השוקה לבין השוקה לפני השוקה. השתמש במטחנים כדי להסיר בזהירות את שכבת האפימיסיום מפני השטח של השריר. בקרסול, השתמש בממטרים כדי לבודד את הגיד לפני השוקיים מהגידים האחרים ולמשוך בעדינות על הגיד כדי לבודד אותו מן השוקה והשרירים שמסביב.כאשר הבטן לפני השוקית מופרדת לחלוטין להחזיק את הגיד למעלה, כך שרק החלק הפרוקסימלי של השריר לפני השוקית מחובר לברך. ולנתק בעדינות את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לפטלה. מניחים את השוקיאליס לפני על חתיכת גזה מעומעמת קלות עם מלוחים כדי למנוע ייבוש.לטבול חלקית מקור המכיל 70 עד 100 מיליליטר של isopentane לתוך מיכל של חנקן נוזלי עד isopentane בתחתית המקור הופך מוצק לבן. בזהירות תווית הצד השני של הפקקים, כך הביופסיה ניתן לזהות כראוי לאחר ההקפאה, ולהוסיף כ 0.5 מיליליטר של מסטיק tragacanth על 20 על ידי 11 על ידי 8 מילימטר חתיכת פקק עגול. השתמש מטליות כדי להטמיע את השוקיים לפני לתוך צד גיד דיסטלי החניכיים למעלה.מחזיק את השריר עם הציר שלו בניצב אל משטח הפקק. לפחות מחצית מהצד של הגיד של השוקית anterior צריך להישאר חשוף על ידי המסטיק. לאחר מכן טובלים במהירות את הפקק עם השריר המוטבע לתוך isopentane מקורר, unfrozen במשך כשתי דקות כדי לאפשר הקפאה מלאה.להשיג חלקים של הרקמה הקפואה, להגדיר את טמפרטורת cryostat למינוס 25 מעלות צלזיוס ולהשתמש תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית כדי לתקן את הרקמה על בלוק חיתוך קריוסטט. חותכים את הדגימה עד בטן השריר הוא הגיע. השג שבעה עד עשרה מקטעי מיקרומטר שאוספים לפחות שני חלקים לשקופית זכוכית וממקמים את השקופיות בטמפרטורת החדר בזמן שהקטעים נלכדים.אפשר לרקמות להתייבש לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה מאווררת. ואז לאחסן את החלק במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מכתימים. אימונולאבל הרקמות.ראשית, להפשיר את המגלשות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות בסביבה מאווררת. לאחר מכן, תן את החלקים באמצעות עט הידרופובי. תקן את הרקמות עם 2% paraformaldehyde במשך 10 דקות בתא לח.בסוף קיבעון לשטוף את החלקים עם שתי 5 דקות שטיפות PBS טרי לכל לשטוף. חסום כל כריכה לא ספציפית עם סרום עיזים 10%מדולל ב- PBS. לאחר שעה בטמפרטורת החדר תווית את החלקים עם נוגדנים ראשוניים של עניין, מדולל 5% סרום עיזים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם שלוש 5 דקות שטיפות PBS בעקבות תיוג עם נוגדנים משניים פלואורופור המתאים גדוש במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות עם שלוש 10 דקות לשטוף PBS. הר את הקטע עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי המכיל 100 ננוגרם למיליליטר של DAPI ותגית כיסוי.ואז לייבש את המגלשות לילה בארבע מעלות צלזיוס לפני הדמיה. השרירים הראשונים Tibialis מעכברי mdx בן ארבעה שבועות לעתים קרובות להציג פרופילים הטרוגניים כולל אזורים מושפעים קשה באזורים ניוון והתחדשות יחד באותו חתך. אזורי שרירים שאינם מושפעים במקצת מכילים את הגודל והגרעין הגדולים וההומוגניים בצפיפות נמוכה הממוקמים בעיקר בפריפריה או בין myofibers.IgG חיובי myofibers נעדרים בדרך כלל באזורים בריאותיים כאלה או מושפעים קלות בעוד אימונואקטיביות IgG בתוך myofibers מציין myonecrosis. myofibers שזה עתה נוצרו נמצאים בגודל קטן בשלבים המוקדמים שלהם של התחדשות בהדרגה הגדלת כמו השרירים הצאצאים להתיך לתרום לתא syncytial. במהלך תהליך זה, myonuclei להישאר במרכז הרקמה המתחדשת עם אשכולות של קטנים, מרכזי nucleated myofibers המציין myofibers מחדש לאחרונה כדי למזער את הסיכון של חפצים חשוב לשמור על השרירים ישר בעת הקפאת הרקמה בטמפרטורה הנכונה.Isopentane ו PFA תמיד צריך להיות מטופלים בזהירות ותחת מכסה המנוע אדים.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

הכנה שימוש הפצעים פאנטום פיין שאיפה לעשייה ביופסיות מחט

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

הערכה של תפקוד שרירים של שריר extensor digitorum Longus<em&gt; גופיים</em&gt; ושריר קדמי tibialis<em&gt; באתר</em&gt; בעכברים

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -induced רשתית ניוון והתחדשות בדג הזברה: היסטולוגית ומאפיינים פונקציונליים

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

איתור של רקמות בקטריה תושב ביופסיות שלפוחית השתן על ידי הזריחה של 16S rRNA באתרו היברידיזציה

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

אוסף של ביופסיות שריר השלד מהתאי העליון של השרירים האנושיים Tibialis הקדמי להערכה מכנית

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...