Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
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이 작품은 Translamuscle 프로그램과 협회 프랑수아즈 콘트레 레 Myopathies에 의해 지원되었다. 저자들은 펄라 레예스-페르난데스 박사와 매튜 보록 박사가 원고를 주의 깊게 읽은 것에 대해 감사를 표합니다.

실험은 프랑스 및 유럽 공동체 법규(라이센스 번호 11-00010)에 따라 수행되었습니다.
1. 트라가칸스 잇몸 준비
<ol><li>유리 비커에 100 mL의 탈이온수에 트라가칸스 분말 6 g을 녹입니다. 호일로 덮고 적어도 3 시간 동안 방치하십시오. 혼합물이 점성이 빠르게 됨에 따라 금속 주걱으로 수동으로 저어줍니다.</li>
	<li>트라가칸스 혼합물을 수조 나 오븐에서 하룻밤 동안 60 °C에서 둡?...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. 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J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber 괴사는 정상적인 근육에서 외상성 운동의 일반적인 결과입니다. 그것은 잘 로컬 근육 선조의 강력한 재생 능력에 의해 보상. 그러나, 여러 근육 조건에서 MDs에서, 위성 세포의 재생 용량 만성 근조와 과도 한 섬유 증에 의해 손상. 최근 연구 결과에 따르면 근육 섬유는 괴사의 규제 형태인 necroptosis에 의해 죽을 수 있습니다. 보다 구체적으로, necroptosis의 억제는 DMD 처리를 위한 새로운 치료 ?...

줄무늬 골격근은 주로 특징적인 자발적 수축 기능을 담당하는 근육 섬유 (myofibers)로 구성됩니다. 이 세포는 수축 도중 일어나는 기계적인 응고를 지원하는 다중 핵화, 포스트 유사분열 구조물입니다. 근섬유소막(사르콜엠마)과 세포외 매트릭스의 구조적 안정성은 조직 항상성에 매우 중요합니다. 위성 세포는 성숙한 골격 근에서 주요 근육 전구 집단을 구성하고 건강한 근육에서 정지 상태에 존재한다. myofiber 죽음 다음, 근육 재생은 궁극적으로 새로운 다핵근 화파이버를 형성하기 위해 위성 세포 활성화, 증식, 분화 및 융합을 포함하는 myogenic 프로그램을 따르는 위성 세포에 의해 지원됩니다.
Myofiber demise는 기계적 외상, 허혈 재관류 상해, 또는 근육 이영양증을 포함하는 다중 근육 조건에서 생길 수 있고, 죽은 세포의 괴사 형태와 연관된다1,2. 괴사염은 혈장막의 급속한 투과성 및 세포외 구획내의 세포 함량의 방출을 특징으로한다 3. 그것은 적절한 세포 신호 (즉, 우발적 인 괴사) 또는 오케스트레이션 된 세포 내 통로 (즉, 조절 된 괴사)를 포함하는 관계가없는 과정중 하나에서 발생할 수 있습니다. myofibers에서, 규제4 및 관계가 없는5 프로세스 는 괴사로 이어질 수 있습니다. 근위병의 전형적인 결과는 손상 관련 분자 패턴의 방출이며, 강력한 염증반응을활성화6. 대식세포의 존재는 부상7다음 약 48 시간 및 72 시간에서 관찰된다. 괴사 파편의 정리에 있는 그들의 역할 이외에, 그(것)들은 또한 근육 재생에 중요합니다8,9.
근 위축증 (MDs)은 종종 사르콜렘 구조의 결함으로 인한 이질적인 병리학 그룹입니다. Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 전 세계 3,500명의 남성 출생 중 대략1에영향을 미치는 청소년 X 연결된 질병이고, sarcolemma에 dystrophin 표현의 부재에 기인합니다. DMD 소년에서 근육 조직의 만성 변성 극단적인 근육 약점 및 초기 사망에 이르게. 괴사에 의한 염증은 세포 독성을 향상시키고 근육 섬유증및 근육 기능의 상실을 촉진한다11,12. 유전자 치료와 같은 근육 퇴행성 질환의 뿌리를 대상으로 하는 임상 시험에서 현재 치료는 근위대증을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 변성을 정확하게 정량화하는 간단한 기술이 필요합니다.
생체 내에서 근섬유 손실을 모니터링하기 위해 여러 가지 방법이 일상적으로 사용됩니다. 혈액내 크레아틴 키나아제(CK)의 효소 활성을 측정하면 근육과 심장 조직에서 지속적인 괴사의 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다. 이 시장에서 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색은 변성 재생 재생을 평가하기 위해 현재 진단에 사용되는 가장 인기 있는 방법입니다. 그러나, 죽은 세포의 H&E 라벨링의 분자 기초는 불분명남아 있습니다. 또한 H&E 염색에서 myofiber 죽음을 암시하는 색상 수정은 상대적으로 미묘하며 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량화를 용이하게하지 않습니다. DNA 단편화를 밝히는 방법, 예: 말단 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL), 불완전 라벨 괴사3. 그(것)들은 또한 myofibers와 같은 동기화한 세포의 죽음을 감시하기 위하여 제대로 적응됩니다. Evan의 청색 염료 (EBD)와 같은 중요한 염료의 주입은 사르콜렘의 무결성을 잃은 근섬유를 평가하기위한 유용한 대안을 나타내지만 일부 실험 프로토콜에서 반드시 편리하지는 않습니다. 예를 들면, 혈액 샘플에 있는 EBD의 존재는 CK 측정, colorimetric 분석결과의 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, EBD의 세포 내 섭취는 공동 면역 라벨링을 어렵게 만듭니다. 따라서 괴사를 겪고있는 myofibers의 직접 라벨링을 허용하는 대체 방법이 흥미 로고입니다.
중요한 염료의 작용 메커니즘은 괴사 성 myofibers의 플라즈마 막 무결성의 손실과 주입 된 염료의 수동 적인 섭취에 의존합니다. 유사하게, 괴사성 근섬유는 알부민과 같은 혈액 단백질을 섭취하며, 이는 EBD가 강한 친화성을 가지는13,14,면역글로불린 G(IgG) 및 IgM15이다. 따라서 myofibers 내의 혈액 단백질의 이상한 존재는 구내에서 근위대근에 대한 편리한 마커를 나타냅니다. 이 단백질을 염색하는 것은 중요한 염료의 사용을 위한 대안이 될 수 있습니다.
IgG 섭취량을 중계근의 마커로 사용하여, 이 프로토콜은 mdx 디스트로핀 결핍 마우스의 경골 전방(TA)에서 근육 변성을 평가하는 데 사용됩니다. 이 방법은 대체 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다: 1) 실행시 재현가능하고 간단합니다. 2) 순환하는 필수 염료의 주입과 같은 근육 수집 전에 어떠한 동물 치료도 필요하지 않으며, 3) 임의의 통상적인 면역라벨링으로서, 공동 라벨링과 호환된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

근육 섬유의 괴사 (myonecrosis)는 근육 이영양증을 포함한 여러 근육 조건의 발병 기전에서 중심적인 역할을합니다. 근 위축병발생의 원인을 해결하는 치료 옵션은 근육 변성을 완화할 것으로 예상된다. 따라서 근육 생검에서 세포 사멸 정도를 분석하고 정량화하는 방법이 필요하다. 종래의 방법은 장소에서 근섬유 변성을 관찰하는 것이 양적 또는 필수 염료의 주입에 의존한다. 본 문서에서, 면역형광 프로토콜은 myofibers에 의한 면역글로불린 G(IgG) 섭취량을 표적으로 하여 괴사 된 myofibers를 염색하는 것을 기술한다. IgG 섭취 방법은 1) 손상 관련 분자 패턴의 방출과 함께 혈장 막 무결성의 손실 및 2) 혈장 단백질의 섭취를 포함하여 괴사 멸망을 특징짓는 세포 특징을 기반으로 한다. 뮤린 단면에서, myofibers, 세포외 매트릭스 단백질 및 마우스 IgG의 공동 면역 표지는 괴사 운명과 myofibers의 깨끗하고 간단한 식별을 허용합니다. 이 간단한 방법은 정량 분석에 적합하고 인간 샘플을 포함한 모든 종에 적용 가능하며, 필수 염료의 주입을 필요로하지 않는다. IgG 섭취량에 의한 괴사 성 myofibers의 염색은 또한 다른 공동 면역 라벨링과 결합 될 수 있습니다.

묘섬유는 라미닌 함유 세포외 기질로 둘러싸여 있습니다. 붉은 얼룩은 근섬유 주변을 제한하고 식별을 허용합니다. IgG는 녹색으로 표시됩니다. 핵은 DAPI로 염색되고 현미경의 밑에 파란 찾아낸다. 그러나 핵은 여기에 흰색으로표시됩니다(그림 1). 약한 IgG 면역 반응성은 염증의 경우에 증가될 수 있는 세포외 구획에서 예상됩니다. 근섬유 내의 녹색 ?...

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Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

여기서 설명된 것은 근육 저온절에서 괴사 성 근섬유의 직접 면역 라벨링을 위한 프로토콜이다. 괴사 세포는 면역 글로불린 G (IgG)를 포함하는 혈청 단백질에 투과성이다. myofibers에 의해 IgG의 섭취를 공개하면 근육 상태에 관계없이 괴사를 겪는 myofibers의 식별 및 정량화를 할 수 있습니다.

근육 생검에 있는 면역 표지하는 Myofiber 변성

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

근섬유 괴사는 다중 신경 근육 장애의 특징이며 병인발생에 중심적인 역할을 합니다. 근육 변성을 평가하기위한 구체적이고 신뢰할 수있는 방법은 진단 및 번역 연구에 중요합니다. 이 매우 적응 가능한 기술은 근섬유 내의 동일한 섹션에서 동시에 다중 항원의 라벨링을 허용합니다.그것은 중요한 염료로 가능합니다. H&E 염색은 안정적이고 재현 가능한 인주에 적응할 수 없는 경험적 방법입니다. IgG 섭취 염색, 그러나, 괴사 근육 세포에 대 한 특정 하 고 인간의 생검에 적용.이 기술은 myonecrosis특징모든 신경 근육 장애에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 관심의 다리에서 머리를 제거 한 후 4 주 된 수컷 mdx 동물을 supine 위치에 배치하고 코르크 보드에 발을 고정시하십시오. 정밀 가위 또는 집게를 사용하여 다리 피부를 무릎으로 제거하여 경골과 티비알리스 전방의 전체 길이를 노출시합니다.가위를 사용하여 경골과 티비알리스 전방 을 절개하십시오. 집게를 사용하여 근육 표면에서 에피미슘 층을 조심스럽게 제거하십시오. 발목에서, 다른 힘줄에서 티비알리스 전방 힘줄을 분리하고 경골과 주변 근육에서 분리하는 힘줄을 부드럽게 당기려면 집게를 사용합니다.티비알리스 전방 배가 완전히 분리되면 힘줄을 들고 티비알리스 전방 근육의 근위 부분만 무릎에 부착되도록 합니다. 그리고 슬개골에 가능한 한 가깝게 근위 힘줄을 부드럽게 끊습니다. 건조를 피하기 위해 식염수로 가볍게 약해진 거즈 조각에 티비알리스 전방을 놓습니다.비커의 바닥에 있는 이스펜탄이 백색 고체가 될 때까지 이스펜타네70 밀리리터의 70~100밀리리터를 액체 질소 용기에 부분적으로 담급니다. 코르크의 반대편을 주의 깊게 미리 라벨을 부착하여 생검을 동결 한 후 제대로 식별할 수 있도록 하고, 약 0.5 밀리리터의 트라가칸스 껌을 20~11mm의 코르크 원형 조각에 추가합니다. 집게를 사용하여 티비알리스 전방을 잇몸 말힘 쪽으로 삽입하십시오.축이 코르크 표면에 수직으로 근육을 유지합니다. 티볼리스 전방의 힘줄 측면의 적어도 절반은 잇몸에 의해 밝혀져야 합니다. 그런 다음 코르크를 차가운 냉동되지 않은 디언타네에 넣고 약 2분 동안 완벽하게 동결할 수 있도록 빠르게 찍어줍니다.냉동 조직의 단면을 얻고, 극저온 온도를 영하 25도로 설정하고 최적의 절삭 온도 화합물을 사용하여 조직을 극저온 절단 블록에 고정시하십시오. 근육 배에 도달 할 때까지 샘플을 손질. 섹션이 캡처될 때 유리 슬라이드당 최소 2개의 섹션을 수집하는 7~10마이크로미터 섹션을 얻을 수 있습니다.통풍이 잘되는 환경에서 실온에서 적어도 20분 동안 티슈가 건조하도록 합니다. 그런 다음 섹션이 얼룩될 때까지 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 조직을 면역 라벨.첫째, 환기 환경에서 적어도 15 분 동안 실온에서 슬라이드를 해동하십시오. 다음으로 소수성 펜으로 섹션을 설명합니다. 습한 챔버에서 10 분 동안 2 %의 paraformaldehyde로 조직을 수정합니다.고정의 끝에서 세척 당 신선한 PBS에 두 5 분 세척으로 섹션을 헹구는. PBS에서 희석된 10%의 염소 혈청으로 비특이적 결합을 차단합니다. 실온에서 1 시간 후 관심의 1 차적인 항체를 가진 단면도를 표시하고, 실온에서 2 시간 동안 5% 염소 혈청으로 희석시.인큐베이션이 끝나면 PBS에서 35분 세척으로 슬라이드를 헹구면 빛으로부터 보호되는 실온에서 45분 동안 적절한 플루오로포레 컨쥬게이징된 이차 항체로 라벨을 부착하여 다음과 같습니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 10분 동안 3개의 세척으로 슬라이드를 씻습니다. DAPI의 밀리리터당 100 나노그램과 커버 슬립을 포함하는 형광 장착 매체로 단면을 장착하십시오.그런 다음 이미징 전에 섭씨 4도에서 밤새 슬라이드를 건조시십시오. 4주 된 mdx 마우스의 티비알리스 전방 근육은 종종 동일한 단면에서 함께 퇴행성 및 재생 영역에서 제대로 영향을 받지 않는 부위를 포함한 이질적인 프로파일을 표시합니다. 약간 영향을 받는 근육 영역에 영향을 받지 않는 근섬유는 크고 균일한 크기와 핵을 주로 주변또는 근섬유 사이로 위치하는 저밀도에서 함유되어 있습니다.IgG 양성 심근섬유는 일반적으로 이러한 건강 또는 약간 영향을받는 부위에 존재하지 않으며 근섬유내의 IgG 면역 반응성은 myonecrosis를 나타냅니다. 새로 형성된 근섬유는 근육 전구가 동기화 세포에 기여함에 따라 점진적으로 확대되는 재생초기 단계에서 작은 크기로 존재한다. 이 과정에서, 근핵은 작고 중앙에 핵화된 근섬유의 클러스터를 가진 재생 조직의 중심에 남아 있으며 최근에 재생된 심섬유를 나타내며, 유물의 위험을 최소화하기 위해 조직을 동결할 때 와 올바른 온도에서 근육에 똑바로 유지하는 것이 중요합니다.이스펜탄과 PFA는 항상 주의깊게 그리고 연기 후드 아래에서 처리되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

준비 및 파인 니들의 열망의 Biopsies 연습을 팬텀 조직 손상을 사용하여

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

연구

생물학

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

신근 Digitorum의 Longus 근육의 근육 기능의 평가<em&gt; 예 생체</em&gt;와 Tibialis 앞쪽에 근육<em&gt; 현장에서</em&gt; 마우스에

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

조직 학적 및 기능적 특성 : Methylnitrosourea (MNU)는 망막 변성과 재생 제브라 피쉬에서 유도 된

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 16S rRNA 형광에 의한 방광 생검의 조직 상주 박테리아 검출

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

골격 근육 생검에서 Myofibrils를 분리하고 나노 뉴턴 해상도 포스 트랜스듀서로 수축 기능을 결정합니다.

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

기계적 평가를 위한 인간 근육 티비아리스 전방의 우수한 구획에서 골격 근육 생검 의 컬렉션

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

성인 근육 줄기 세포 기능 전 비보의 평가를위한 단일 근섬유 배양 분석

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...