Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av foreningen Française contre Les myopatier med Translamuscle programmet. Forfatterne takker Dr. Perla Reyes-Fernandez og Dr. Matthew Borok for deres nøye lesning av manuskriptet.

Eksperimenter ble utført i samsvar med den franske og europeiske fellesskapslovgivningen (lisensnummer 11-00010).
1. Tragacanth tannkjøtt forberedelse
<ol><li>I et glass beger, oppløse 6 g tragacanth pulver i 100 mL deionisert vann. Dekk med folie og la stå i minst 3 h. noen ganger røre manuelt med en metallspatel som blandingen raskt blir tyktflytende.</li>
	<li>La tragacanth blandingen ved 60 ° c over natten i et vannbad eller i ovnen. Forsiktig forsegle begeret for å unngå tørkin...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber nekrose er en vanlig konsekvens av traumatisk trening i normale muskler. Det er godt kompensert av en kraftig regenererende kapasitet på den lokale muskel forfedre. Men, i flere muskel forhold som i MDs, regenererende kapasitet av satellitt celler er kompromittert av kroniske myonecrosis og overdreven fibrose. Nylige funn viser at muskelfibre kan dø av necroptosis, en regulert form for nekrose. Mer spesifikt kan hemming av necroptosis bli en ny terapeutisk strategi for DMD behandling4. ...

Striated Skjelettmuskel består hovedsakelig av muskelfibre (myofibers), som er ansvarlig for den karakteristiske frivillige kontraktile funksjon. Disse cellene er multinucleated, post-mitotisk strukturer som støtter mekanisk stress oppstår under sammentrekning. Strukturell stabilitet av myofiber membran (sarcolemma) og dens ekstracellulære matrise er avgjørende for vev homeostase. Satellitt celler utgjør den viktigste muskelen Stam befolkningen i modne skjelettlidelser muskel og finnes i en Quiescent tilstand i sunne muskler. Etter myofiber død, muskel regenerering støttes av satellitt celler etter en myogenic program som involverer satellitt celle aktivering, spredning, differensiering, og fusjon til slutt danne nye multinucleated myofibers.
Myofiber død kan forekomme i flere muskel forhold, inkludert mekaniske traumer, iskemi-reperfusion skader, eller muskuløse dystrofi, og det er forbundet med nekrotisk morfologi av døde celler1,2. Nekrotisk død er karakterisert ved rask permeabilitet av plasma membranen og frigjøring av celleinnhold i ekstracellulære kupé3. Det kan skyldes enten en uregulert prosess som involverer ingen skikkelig celle signal (dvs. utilsiktet nekrose), eller en orkestrert intracellulære veien (dvs. regulert nekrose). I myofibers, både regulert4 og uregulert5 prosesser kan føre til nekrose. En typisk konsekvens av myonecrosis er utgivelsen av skade-forbundet molekyl mønstre, aktivere en kraftig inflammatorisk respons6. Tilstedeværelsen av makrofager er observert på rundt 48 h og 72 h etter skade7. Foruten deres rolle i clearance av nekrotisk rusk, de er også viktig i muskel regenerering8,9.
Muskuløse dystrofi (MDs) er en heterogen gruppe av patologi som ofte skyldes en defekt i sarcolemma struktur. Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en juvenil X-koblet sykdom som berører ca 1 av hver 3 500 mannlige fødsler over hele verden10, og det er forårsaket av fraværet av dystrofingenet uttrykk på sarcolemma. Kronisk degenerasjon av muskel vev i DMD gutter fører til ekstrem muskelsvakhet og tidlig dødelighet. Betennelse som følge av nekrotisk død forbedrer cytotoksisitet, og fremmer muskel fibrose og tap av muskel funksjon11,12. Behandlinger for tiden i kliniske studier rettet mot røttene av muskel degenerative lidelser, som genterapi, forventes å lindre myonecrosis. Enkle teknikker for å nøyaktig kvantifisere muskel degenerasjon er derfor nødvendig.
Flere metoder brukes rutinemessig til å overvåke myofiber tap in vivo. Målingen av enzymatisk aktivitet av kreatin kinase (CK) i blodet gir pålitelig kvantifisering av pågående nekrose i muskler og hjerte vev. In situ, den haematoxylin og eosin (H & E) farging er den mest populære metoden i dag brukes i diagnosen for å vurdere degenerasjon-regenerering Remodelling. Imidlertid er det molekylære grunnlaget for H & E merking av døde celler uklart. Videre farge modifikasjoner antyder myofiber død i H & E flekker er relativt subtile og ikke rette for pålitelig og reproduserbar kvantifisering. Metoder avslørende DNA fragmentering, slik som Terminal deoksynukleotidyltransferase glutamyltransferase dUTP Nick end merking (TUNEL), ufullkomment Label nekrotisk død3. De er også dårlig tilpasset for å overvåke dødsfallet til syncytial celler som myofibers. Injeksjon av vitale fargestoffer, slik som Evan ' s blå fargestoff (EBD), representerer et nyttig alternativ for å vurdere myofibers som har mistet integriteten til sarcolemma, men er ikke nødvendigvis praktisk i noen eksperimentelle protokoller. For eksempel kan tilstedeværelsen av EBD i blodprøver påvirke resultatene av CK målinger, et fargemetrisk analysen. Videre gjør intracellulære opptak av EBD immunolabelling utfordrende. Derfor, en alternativ metode som tillater direkte merking av myofibers gjennomgår nekrose er av interesse.
Virkningsmekanismen av vitale fargestoffer er avhengig av tap av plasma membran integritet i nekrotisk myofibers og passiv opptak av injisert fargestoff. Tilsvarende nekrotisk myofibers opptak Blodproteiner som albumin, der EBD har en sterk affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), og IgM15. Den unormale forekomsten av Blodproteiner i myofibers representerer derfor praktiske markører for myonecrosis in situ. Farging av disse proteinene kan være et alternativ for bruk av vitale fargestoffer.
Ved å bruke IgG opptak som en markør for myonecrosis in situ, denne protokollen brukes til å vurdere muskel degenerasjon i tibialispuls fremre (TA) av MDX dystrofingenet-mangelfull mus. Denne metoden presenterer betydelige fordeler fremfor alternative teknikker: 1) det er reproduserbar og enkel i utførelsen sin; 2) det krever ingen dyr behandling før muskel oppsamling, slik som injeksjon av sirkulerende vitale fargestoffer, og 3) som enhver konvensjonell immunolabelling, den er kompatibel med co-merking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Nekrose av muskelfibre (myonecrosis) spiller en sentral rolle i patogenesen av flere muskel forhold, inkludert muskel dystrofi. Terapeutiske alternativer adressering årsakene til muskel dystrofi patogenesen er ventet å lindre muskel degenerasjon. Derfor en metode for å analysen og kvantifisere omfanget av cellen død i muskel biopsier er nødvendig. Konvensjonelle metoder for å observere myofiber degenerasjon in situ er enten dårlig kvantitative eller stole på injeksjon av vitale fargestoffer. I denne artikkelen er en immunofluorescence protokoll beskrevet som flekker nekrotisk myofibers ved å målrette immunglobulin G (IgG) opptak av myofibers. IgG opptaket metoden er basert på celle funksjoner karakteriserer nekrotisk bortgang, inkludert 1) tap av plasma membran integritet med utgivelsen av skade-tilknyttede molekylære mønstre og 2) opptaket av plasmaproteiner. I murine tverrsnitt, immunolabelling av myofibers, ekstracellulære matrise proteiner, og mus IgG tillater ren og grei identifisering av myofibers med nekrotisk skjebne. Denne enkle metoden er egnet for kvantitativ analyse og gjelder for alle arter, inkludert menneskelige prøver, og krever ikke injeksjon av vitale fargestoff. Farging av nekrotisk myofibers av IgG-opptak kan også pares med andre co-immunolabelling.

Myofibers er omgitt av en laminin-inneholdende ekstracellulære matrise. Rød farging avgrenser myofibers periferi og gir mulighet for deres identifikasjon. IgG er vist i grønt. Kjerner er farget med DAPI og er funnet blå under mikroskopet. Men kjerner er vist i hvitt her (figur 1). En svak IgG-immunoreactivity forventes i ekstracellulære rommet, som kan økes i tilfelle betennelse. Grønne flekker innenfor myofibers reflekterer tilstedeværelsen av IgG.</...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Beskrevet her er en protokoll for direkte immunolabelling av nekrotisk myofibers i muskel cryosections. Nekrotisk celler er gjennomtrengelig for serumproteiner, inkludert immunglobulin G (IgG). Avslører opptaket av IgG ved myofibers tillater identifisering og kvantifisering av myofibers som gjennomgår nekrose uavhengig av muskel tilstand.

Immunolabelling Myofiber degenerasjon i muskel biopsier

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Myofiber nekrose er karakteristisk for flere nevromuskulære lidelser og spiller en sentral rolle i patogenesen. En spesifikk, pålitelig metode for å vurdere muskeldegenerasjon er viktig for diagnose og translasjonell forskning. Denne ekstremt tilpasningsdyktige teknikken tillater merking av flere antigen som samtidig i samme avsnitt innenfor den myofibers.Det er mulig med vitale fargestoffer. H&E-farging er en empirisk metode som ikke kan tilpasses for pålitelig og reproduserbar bøyning. IgG opptak farging, men, er spesifikk for nekrotiske muskelceller og gjelder for menneskelige biopsier.Denne teknikken kan gi innsikt i alle nevromuskulære lidelser preget av myonecrosis. Etter å ha fjernet håret fra interessebenet, plasser det fire uker gamle mannlige MDX-dyret i liggende stilling og fest potene til et korkbrett. Ved hjelp av presisjon saks eller tang fjerne benhuden fra foten til kneet for å utsette hele lengden av tibia og tibialis fremre.Bruk saksen til å gjøre et snitt mellom tibia og tibialis fremre. Bruk tang til å forsiktig fjerne epimysiumlaget fra overflaten av muskelen. Ved ankelen, bruk tangen til å isolere tibialis fremre sen fra de andre senene og trekk forsiktig opp på senen for å isolere den fra tibia og de omkringliggende musklene.Når tibialis fremre mage har helt skilt hold senen opp slik at bare den proksimale delen av tibialis fremre muskel er festet til kneet. Og forsiktig bryte proksimal sene så nært som mulig til patella. Plasser tibialis fremre på et stykke gasbind lett fuktet med saltvann for å unngå tørking.Dypp delvis et beger som inneholder 70 til 100 milliliter isopentan i en beholder med flytende nitrogen til isopentanen nederst på begeret blir et hvitt fast stoff. Forhåndsmerke den andre siden av korkene slik at biopsien kan identifiseres riktig etter frysing, og tilsett ca. 0,5 milliliter tragacanth tyggegummi på et 20 og 11 med 8 millimeter sirkulært stykke kork. Bruk tang til å legge tibialis fremre i tannkjøttet distal sene side opp.Holder muskelen med sin akse vinkelrett på kork overflaten. Minst halvparten av senen siden av tibialis fremre bør forbli avdekket av tannkjøttet. Dypp deretter korken raskt med den innebygde muskelen i den avkjølte, ufrosne isopentanen i ca to minutter for å tillate fullstendig frysing.Få deler av det frosne vevet, sett kryostattemperaturen til minus 25 grader Celsius og bruk optimal skjæretemperaturforbindelse for å fikse vevet på kryostatkutteblokken. Trim prøven til muskelmagen er nådd. Få syv til ti mikrometerseksjoner som samler minst to seksjoner per glasssklie og plasserer lysbildene ved romtemperatur når seksjonene fanges.La vevet tørke i minst 20 minutter ved romtemperatur i et ventilert miljø. Oppbevar deretter seksjonen på minus 80 grader Celsius til de er farging. Immunolabel vevet.Først tine lysbildene ved romtemperatur i minst 15 minutter i det ventilerte miljøet. Deretter avgrenser du seksjonene med en hydrofob penn. Fest vevet med 2% paraformaldehyd i 10 minutter i et fuktig kammer.På slutten av en fiksering skyll seksjonene med to 5 minutters vasker i frisk PBS per vask. Blokker enhver ikke-spesifikk binding med 10 % geiteserum fortynnet i PBS. Etter 1 time ved romtemperatur merker seksjonene med primære antistoffer av interesse, fortynnet i 5% geiteserum i 2 timer ved romtemperatur.På slutten av inkubasjonen, skyll lysbildene med tre 5 minutters vasker i PBS følger ved merking med riktig fluorofor konjugert sekundære antistoffer i 45 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene med tre 10 minutters vasker i PBS. Monter avsnittet med et fluorescerende monteringsmedium som inneholder 100 nanogram per milliliter DAPI og en dekselslipp.Tørk deretter lysbildene over natten på fire grader Celsius før avbildning. Tibialis fremre muskler fra fire uker gamle mdx mus viser ofte heterogene profiler, inkludert dårlig berørte områder i degenererende og regenererende områder sammen i samme tverrsnitt. Upåvirket til mildt berørte muskelområder inneholder myofibers av stor og homogen størrelse og kjerner ved lav tetthet som hovedsakelig ligger i periferien eller mellom myofibers.IgG positive myofibers er generelt fraværende i slike helse eller mildt berørte områder mens IgG immunoreaktivitet i myofibers indikerer myonecrosis. Nydannede myofibers er til stede i liten størrelse i deres tidlige stadier av regenerering gradvis forstørrende som muskel stamfar smelter i bidra til syncytial celle. Under denne prosessen forblir myonuclei i sentrum av det regenererende vevet med klynger av små, sentralt kjernede myofibers som indikerer nylig regenerert myofibers For å minimere risikoen for gjenstander er det viktig å holde i musklene rett når du fryser vevet og ved riktig temperatur.Isopentane og PFA bør alltid håndteres med forsiktighet og under en røykhette.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluering av muskel-funksjon av extensor digitorum longus Muscle<em&gt; Ex vivo</em&gt; Og tibialis anterior Muscle<em&gt; I situ</em&gt; I Mus

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering av Myospheres Fra hESCs av Epigenetic Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -indusert Retinal degenerasjon og regenerasjon i Sebrafisk: histologiske og funksjonelle egenskaper

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Påvisning av tissue-Resident bakterier i blæren biopsier av 16S rRNA fluorescens in situ hybridisering

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Isolere Myofibrils fra skjelettmuskulaturbiopsier og bestemme kontraktil funksjon med en Nano-Newton oppløsning force transduser

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering av humane ventrikulære kardiomyocytter fra vibratom-cut myokardskiver

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Innsamling av skjelettmuskulaturbiopsier fra Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for mekanisk evaluering

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay for vurdering av voksen muskel stamcelle funksjonalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...