Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Associação Française contre les Myopathies com o programa Translamuscle. Os autores agradecem ao Dr. Perla Reyes-Fernandez e ao Dr. Matthew Borok por sua leitura cuidadosa do manuscrito.

Os experimentos foram realizados de acordo com a legislação da Comunidade Francesa e Europeia (licença número 11-00010).
1. Preparação da goma de Tragacanth
<ol><li>Em um copo de vidro, dissolva 6 g de pó de tragacanth em 100 mL de água desionizada. Cubra com papel alumínio e deixe por pelo menos 3 h. Ocasionalmente mexa manualmente com uma espátula de metal como a mistura rapidamente se torna viscosa.</li>
	<li>Deixe a mistura de tragacanth a 60 °C durante a noite em um banho de ...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. 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J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Necrose da miofibra é uma conseqüência comum do exercício traumático em músculos normais. É bem compensado por uma poderosa capacidade regenerativa dos progenitores musculares locais. No entanto, em várias condições musculares, como em DMs, a capacidade regenerativa das células de satélite é comprometida pela mioneconese crônica e fibrose excessiva. Os resultados recentes mostram que as fibras musculares podem morrer por necroptose, uma forma regulada de necrose. Mais especificamente, a inibição da necrop...

O músculo esquelético estriado consiste principalmente em fibras musculares (miofibras), que são responsáveis pela função contélica voluntária característica. Essas células são estruturas multinucleadas e pós-mitocômicas que suportam o estresse mecânico ocorrendo durante a contração. A estabilidade estrutural da membrana de miofibra (sarcolemia) e sua matriz extracelular são cruciais para a homeostase do tecido. As células de satélite compreendem a principal população de progenitores musculares no músculo esquelético maduro e existem em estado quiescente em músculos saudáveis. Após a morte por miofibra, a regeneração muscular é apoiada por células via satélite após um programa miogênico que envolve ativação de células via satélite, proliferação, diferenciação e fusão para, em última análise, formar novas miofibras multinucleadas.
A morte da miofibra pode ocorrer em múltiplas condições musculares, incluindo trauma mecânico, lesões de isquemia-reperfusão ou distrofias musculares, e está associada à morfologia necrótica das células mortas1,2. A morte necrótica é caracterizada pela permeabilidade rápida da membrana plasmática e liberação de conteúdo celular no compartimento extracelular3. Pode resultar de um processo não regulamentado que não envolva nenhuma sinalização celular adequada (ou seja, necrose acidental) ou de uma via intracelular orquestrada (ou seja, necrose regulada). Em miofibras, ambos regulamentados4 enão regulamentados 5 processos podem levar à necrose. Uma conseqüência típica da mioneconese é a liberação de padrões de moléculas associados a danos, ativando uma poderosa resposta inflamatória6. A presença de macrófagos é observada em torno de 48 h e 72 h após lesão7. Além de seu papel na limpeza de detritos necróticos, eles também são importantes na regeneração muscular8,9.
Distrofias musculares (DM) são um grupo heterogêneo de patologias que muitas vezes resultam de um defeito na estrutura da sarcolema. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença juvenil ligada ao X que afeta aproximadamente 1 em cada 3.500 nascimentos masculinos em todo o mundo10,e é causada pela ausência de expressão de distrofina na sarcolema. A degeneração crônica do tecido muscular em meninos dmd leva a extrema fraqueza muscular e mortalidade precoce. Inflamação resultante da morte necrótica aumenta a citotoxicidade, e promove a fibrose muscular e a perda da função muscular11,12. Tratamentos atualmente em ensaios clínicos visando as raízes de distúrbios degenerativos musculares, como a terapia gênica, são esperados para aliviar a mioneconese. Técnicas simples para quantificar com precisão a degeneração muscular são, portanto, necessárias.
Vários métodos são rotineiramente usados para monitorar a perda de miofibra in vivo. A medição da atividade enzimática da cineza de creatina (CK) no sangue permite quantificação confiável da necrose contínua nos tecidos musculares e cardíacos. In situ, a coloração hematoxilina e eosina (H&E) é o método mais popular usado atualmente no diagnóstico para avaliar a remodelação da regeneração da degeneração. No entanto, a base molecular da rotulagem de H&E das células mortas ainda não está clara. Além disso, modificações de cor que sugerem morte por miofibra na coloração de H&E são relativamente sutis e não facilitam a quantificação confiável e reproduzível. Métodos que revelam a fragmentação do DNA, como o terminal desoxinucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL), imperfeitamente rotular morte necrótica3. Eles também são mal adaptados para monitorar a morte de células sincrial, como miofibras. A injeção de corantes vitais, como o corante azul de Evan (EBD), representa uma alternativa útil para avaliar miofibras que perderam a integridade da sarcolema, mas não é necessariamente conveniente em alguns protocolos experimentais. Por exemplo, a presença de EBD em amostras de sangue pode afetar os resultados das medições de CK, um ensaio colorimétrico. Além disso, a adposição intracelular de EBD torna a co-imunorotulagem desafiadora. Portanto, um método alternativo que permite a rotulagem direta das miofibras submetidas à necrose é de interesse.
O mecanismo de ação de corantes vitais depende da perda da integridade da membrana plasmática em miofibras necróticas e da captação passiva do corante injetado. Da mesma forma, as miofibras necróticas captam proteínas do sangue, como a albumina, para a qual a EBD tem uma forte afinidade13,14, imunoglobulina G (IgG) e IgM15. A presença anormal de proteínas do sangue dentro de miofibras, portanto, representa marcadores convenientes para mioneconese in situ. Manchar estas proteínas pode ser uma alternativa para o uso de corantes vitais.
Usando a captação de IgG como um marcador da mioneconese in situ, este protocolo é usado para avaliar a degeneração muscular no tibialis anterior (TA) de camundongos deficientes em distrophina mdx. Este método apresenta vantagens significativas sobre técnicas alternativas: 1) é reproduzível e simples em sua execução; 2) não requer qualquer tratamento animal antes da coleta muscular, como a injeção de corantes vitais circulantes, e 3) como qualquer imunorotulagem convencional, é compatível com a co-rotulagem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

A necrose das fibras musculares (mionecrose) desempenha um papel central na patogênese de várias condições musculares, incluindo distrofias musculares. Espera-se que as opções terapêuticas que abordem as causas da patogênese da distrofia muscular aliviem a degeneração muscular. Portanto, um método para ensaio e quantificar a extensão da morte celular em biópsias musculares é necessário. Métodos convencionais para observar a degeneração da miofibra in situ são pouco quantitativos ou dependem da injeção de corantes vitais. Neste artigo, um protocolo de imunofluorescência é descrito que mancha miofibras necróticas, visando a captação de imunoglobulina G (IgG) por miofibras. O método de captação de IgG é baseado em características celulares que caracterizam a morte necrótica, incluindo 1) a perda de integridade da membrana plasmática com a liberação de padrões moleculares associados a danos e 2) a captação de proteínas plasmáticas. Nas seções transversais de urina, a co-imunorotulagem de miofibras, proteínas de matriz extracelular e o mouse IgG permite a identificação limpa e direta das miofibras com destino necrótico. Este método simples é adequado para análise quantitativa e aplicável a todas as espécies, incluindo amostras humanas, e não requer a injeção de tinudura vital. A coloração de miofibras necróticas pela captação de IgG também pode ser emparelhada com outras co-imunorotulagem.

As miofibras estão cercadas por uma matriz extracelular contendo laminina. A coloração vermelha delimita a periferia das miofibras e permite sua identificação. IgG é mostrado em verde. Os núcleos são manchados com DAPI e são encontrados azuis o microscópio. No entanto, os núcleos são mostrados em branco aqui (Figura 1). Uma imunoreatividade IgG fraca é esperada no compartimento extracelular, que pode ser aumentado em caso de inflamação. A color...

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Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Descrito aqui é um protocolo para imunorotulagem direta de miofibras necróticas em criosecções musculares. As células necróticas são permeáveis para as proteínas séricas, incluindo a imunoglobulina G (IgG). Revelar a captação de IgG por miofibras permite a identificação e quantificação de miofibras que sofrem necrose, independentemente da condição muscular.

Imunolabellagem de degeneração da miofibra em biópsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

A necrose do miofibra é característica de múltiplas doenças neuromusculares e desempenha um papel central na patogênese. Um método específico e confiável para avaliar a degeneração muscular é importante para o diagnóstico e a pesquisa translacional. Esta técnica extremamente adaptável permite a rotulagem de antígeno múltiplo ao mesmo tempo na mesma seção dentro dessa miofibers.É possível com corantes vitais. A coloração de H&E é um método empírico que não é adaptável para conjugação confiável e reprodutível. A coloração da absorção de IGG, no entanto, é específica para células musculares necróticas e aplicável às biópsias humanas.Esta técnica pode fornecer insights sobre todos os distúrbios neuromusculares caracterizados pela micose. Depois de remover o cabelo da perna de interesse coloque o animal mdx macho de quatro semanas na posição supina e fixar as patas em uma tábua de rolha. Usando tesouras de precisão ou fórceps, remova a pele da perna do pé para o joelho para expor toda a extensão da tíbia e tibialis anterior.Use a tesoura para fazer uma incisão entre a tíbia e a tibialis anterior. Use fórceps para remover cuidadosamente a camada de epimísio da superfície do músculo. No tornozelo, use os fórceps para isolar o tendão anterior tibialis dos outros tendões e puxar suavemente para cima no tendão para isolá-lo da tíbia e dos músculos circundantes.Quando a barriga tibialis anterior tiver separado inteiramente o tendão para que apenas a parte proximal do músculo tibialis anterior seja presa ao joelho. E corte suavemente o tendão proximal o mais próximo possível da patela. Coloque a tibialis anterior em um pedaço de gaze levemente umedecido com soro fisiológico para evitar a secagem.Mergulhe parcialmente um béquer contendo 70 a 100 mililitros de isopentane em um recipiente de nitrogênio líquido até que a isoperne no fundo do béquer se torne um sólido branco. Prec rotulado cuidadosamente o outro lado das rolhas para que a biópsia possa ser devidamente identificada após o congelamento, e adicione aproximadamente 0,5 mililitros de chiclete tragacanth em uma peça circular de 20 por 11 por 8 milímetros de cortiça. Use fórceps para incorporar a tibialis anterior no lado do tendão distal da gengiva para cima.Segurando o músculo com seu eixo perpendicular à superfície da rolha. Pelo menos metade do lado tendinoso da tibialis anterior deve permanecer descoberto pela gengiva. Em seguida, mergulhe rapidamente a rolha com o músculo embutido na isopentane gelada e descongelada por cerca de dois minutos para permitir o congelamento completo.Obtenha seções do tecido congelado, coloque a temperatura do criostat para menos 25 graus Celsius e use o composto de temperatura de corte ideal para fixar o tecido no bloco de corte criostat. Corte a amostra até que a barriga muscular seja atingida. Obtenha de sete a 10 seções de micrômetros coletando pelo menos duas seções por deslizamento de vidro colocando os slides à temperatura ambiente à medida que as seções são capturadas.Deixe os tecidos secarem por pelo menos 20 minutos à temperatura ambiente em um ambiente ventilado. Em seguida, armazene a seção a menos 80 graus Celsius até que eles estejam manchando. Imunolabel os tecidos.Primeiro, descongele os slides à temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos no ambiente ventilado. Em seguida, delineie as seções com uma caneta hidrofóbica. Fixar os tecidos com 2% de paraformaldeído por 10 minutos em uma câmara úmida.No final de uma fixação enxágue as seções com duas lavagens de 5 minutos em PBS fresco por lavagem. Bloqueie qualquer ligação não específica com soro de cabra de 10% diluído em PBS. Após 1 hora no rótulo de temperatura ambiente as seções com anticorpos primários de interesse, diluídas em soro de cabra de 5% por 2 horas em temperatura ambiente.No final da incubação, enxágue os slides com três lavagens de 5 minutos em PBS siga rotulando com os anticorpos secundários conjugados fluoróforos apropriados por 45 minutos à temperatura ambiente protegidos da luz. No final da incubação, lave os slides com três lavagens de 10 minutos em PBS. Monte a seção com um meio de montagem fluorescente contendo 100 nanogramas por mililitro de DAPI e um deslizamento de cobertura.Em seguida, seque as lâminas durante a noite em quatro graus Celsius antes da imagem. Os músculos anteriores tibialis de quatro semanas de idade mdx camundongos frequentemente exibem perfis heterogêneos, incluindo áreas mal afetadas em áreas degeneradas e regeneradoras juntos na mesma seção transversal. Não afetados por áreas musculares levemente afetadas contêm miofibers de grande e homogêneo e núcleos em baixa densidade que estão localizados principalmente na periferia ou entre os miofibers.Os myofibers positivos do IGG estão geralmente ausentes em tais áreas de saúde ou levemente afetadas, enquanto a imunoreatividade IgG dentro dos miofibers indica micose. Os miofibers recém-formados estão presentes em um pequeno tamanho em seus estágios iniciais de regeneração aumentando progressivamente à medida que os progenitores musculares se fundem em contribuir para a célula sincicial. Durante esse processo, os mionucleis permanecem no centro do tecido regenerador com aglomerados de miofibers pequenos e centralmente nucleados indicando miofibers recentemente regenerados Para minimizar o risco de artefatos é importante manter nos músculos em linha reta ao congelar o tecido e na temperatura correta.Isopentane e PFA devem ser sempre manuseadas com cautela e sob um capô de fumaça.

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