Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Эта работа была поддержана Ассоциацией Франсез contre les Myopathies с программой Translamuscle. Авторы благодарят д-ра Перлу Рейес-Фернандес и доктора Мэтью Борока за тщательное прочтение рукописи.

Эксперименты проводились в соответствии с законодательством Франции и Европейского сообщества (лицензия No 11-00010).
1. Tragacanth препарат десен
<ol><li>В стакане растворите 6 г порошка трагаканта в 100 мл деионизированной воды. Накройте фольгой и оставьте не менее 3 ч. Иногда перемеш...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Миофибр некроз является общим следствием травматических упражнений в нормальных мышцах. Он хорошо компенсируется мощной регенеративной способностью местных мышечных прародителей. Однако, в нескольких мышечных условиях, таких как в MDs, регенеративная способность спутниковых клеток с...

Стриженные скелетные мышцы в основном состоят из мышечных волокон (миофибы), которые отвечают за характерную добровольную контрактную функцию. Эти клетки многоядерных, пост-митотических структур, которые поддерживают механический стресс, происходящих во время сокращения. Структурная стабильность мембраны миофибра (саркольма) и ее внеклеточной матрицы имеют решающее значение для ткани гомеостаза. Спутниковые клетки составляют основную популяцию предтека мышц в зрелой скелетной мышце и существуют в состоянии покоя в здоровых мышцах. После смерти миофибра, регенерация мышц поддерживается спутниковыми клетками после миогенной программы, которая включает в себя активацию спутниковых клеток, пролиферацию, дифференциацию и синтез, чтобы в конечном итоге сформировать новые многоядерные миофибы.
Миофибра кончина может произойти в нескольких мышечных условиях, в том числе механические травмы, ишемия-реперфузии травм, или мышечной дистрофии, и это связано с некротической морфологии мертвых клеток1,2. Некротическая смерть характеризуется быстрой проницаемостью плазменной мембраны и высвобождением клеточного содержания в внеклеточном отсеке3. Это может быть результатом либо нерегулируемого процесса, не включающего надлежащей сигнализации клеток (т.е. случайного некроза), либо организованного внутриклеточного пути (т.е. регулируемого некроза). В миофидерах, как регулируемые4, так и нерегулируемые5 процессов могут привести к некрозу. Типичным следствием мионекроза является высвобождение связанных с повреждением молекул, активируя мощный воспалительный ответ6. Присутствие макрофагов наблюдается на уровне около 48 ч и 72 ч после травмы7. Помимо своей роли в расчистке некротического мусора, они также играют важную роль в регенерации мышц8,9.
Мышечные дистрофии (МД) представляют собой неоднородную группу патологий, которые часто являются результатом дефекта в структуре сарколеммы. Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является несовершеннолетним X-связанных заболеваний, затрагивающих примерно 1 из каждых 3500 мужских рождений во всем мире10, и это вызвано отсутствием экспрессии дистрофина в сарколемме. Хроническая дегенерация мышечной ткани у мальчиков DMD приводит к крайней мышечной слабости и ранней смертности. Воспаление в результате некротической смерти повышает цитотоксичность, и способствует мышечный фиброз и потеря мышечной функции11,12. Лечение в настоящее время в клинических испытаниях ориентации корни мышечных дегенеративных расстройств, таких как генная терапия, как ожидается, облегчить мионекрез. Простые методы для точной количественной оценки мышечной дегенерации, следовательно, необходимы.
Несколько методов обычно используются для мониторинга потери миофибра in vivo. Измерение ферментативной активности креатина киназы (КК) в крови позволяет надежно очислить продолжающийся некроз в мышечных и сердечных тканях. На месте, гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание является наиболее популярным методом в настоящее время используется в диагностике для оценки дегенерации регенерации ремоделирования. Тем не менее, молекулярная основа маркировки Н И Е мертвых клеток остается неясной. Кроме того, цветовые изменения, предполагающие смерть миофибра при окрашивании Н и Е, являются относительно тонкими и не способствуют надежной и воспроизводимой количественной оценке. Методы выявления фрагментации ДНК, такие как терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL), несовершенно ярлык некротической смерти3. Они также плохо приспособлены для мониторинга смерти синцитиальных клеток, таких как миофибы. Инъекции жизненно важных красителей, таких как синий краситель Эвана (EBD), представляет собой полезную альтернативу для оценки миофиберов, которые потеряли целостность сарколеммы, но не обязательно удобно в некоторых экспериментальных протоколов. Например, наличие EBD в образцах крови может повлиять на результаты измерений CK, колористетрического анализа. Кроме того, внутриклеточного поглощения EBD делает совместноиммуномаркировки сложной задачей. Таким образом, представляет интерес альтернативный метод, позволяющий прямое маркировка миофибы, проходящих некроз.
Механизм действия жизненно важных красителей зависит от потери целостности плазменной мембраны в некротических миофимерах и пассивного поглощения инъекционного красителя. Аналогичным образом, некротические миофиберы усваивают белки крови, такие как альбумин, для которого EBD имеет сильное сродство13,14, иммуноглобулин G (IgG), и IgM15. Ненормальное присутствие белков крови в myofibers поэтому представляет собой удобные маркеры для мионекроза на месте. Окрашивание этих белков может быть альтернативой для использования жизненно важных красителей.
Используя поглощение IgG в качестве маркера мионекроза на месте, этот протокол используется для оценки мышечной дегенерации в передней tibialis (TA) mdx dystrophin-дефицитных мышей. Этот метод представляет значительные преимущества перед альтернативными методами: 1) он воспроизводим и прост в своем исполнении; 2) он не требует лечения животных до сбора мышц, таких как инъекция циркулирующих жизненно важных красителей, и 3) как любой обычный иммуномаркировки, он совместим с совместной маркировки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Некроз мышечных волокон (мионекрез) играет центральную роль в патогенеза нескольких мышечных состояний, включая мышечную дистрофию. Терапевтические варианты решения причин мышечной дистрофии патогенеза, как ожидается, облегчить дегенерацию мышц. Таким образом, метод для оценки и количественной степени смерти клеток в биопсии мышц необходимо. Обычные методы для наблюдения дегенерации миофипла на месте либо плохо количественные или полагаться на инъекции жизненно важных красителей. В этой статье описывается протокол иммунофлуоресценции, который окрашивает некротические миофиберы, нацеливая на иммуноглобулин G (IgG) поглощение миофиберами. Метод поглощения IgG основан на клеточных особенностях, характеризующих некротическую кончину, включая 1) потерю целостности плазменной мембраны с высвобожденными молекулярными паттернами, связанными с ущербом, и 2) поглощением плазменных белков. В поперечных сечениях, совместноиммуномаркировки миофиберов, внеклеточных матричных белков, и мыши IgG позволяет чистой и прямой идентификации миофиберов с некротической судьбой. Этот простой метод подходит для количественного анализа и применим ко всем видам, включая образцы человека, и не требует инъекций жизненно важного красителя. Окрашивание некротических миофиберов поглощением IgG также может быть сопряжено с другими совместно иммуномаркировки.

Миофибы окружены ламининосодержащей внеклеточной матрицей. Красное окрашивание разграничает периферию миофиферов и позволяет их идентифицировать. IgG показан зеленым цветом. Ядра окрашены DAPI и находятся синий под микроскопом. Тем не менее, ядра показаны в белом здесь...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Описано здесь протокол для прямой иммуномаркировки некротических миофибы в мышечных криосекциях. Некротические клетки проницаемы белками сыворотки, включая иммуноглобулин G (IgG). Выявление поглощения IgG миофибарами позволяет идентификации и количественной оценки миофидеров, которые проходят некроз независимо от состояния мышц.

Иммуномаркировка дегенерации миофибра при биопсии мышц

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Некроз миофибера характерен для множественных нервно-мышечных расстройств и играет центральную роль в патогенезе. Специфический, надежный метод оценки мышечной дегенерации имеет важное значение для диагностики и трансляционных исследований. Этот чрезвычайно адаптируемый метод позволяет маркировки нескольких антигенов, как то же время в том же разделе в том, что myofibers.Это возможно с жизненно важными красителями. Окрашивание Н И Е является эмпирическим методом, который не адаптируется для надежного и воспроизводимого спряжения. IgG поглощения окрашивания, однако, специфичен для некротических мышечных клеток и применимы к биопсии человека.Этот метод может дать представление о всех нервно-мышечных расстройств характеризуется мионекроза. После удаления волос с ноги интерес место четырехнедельный мужчина mdx животных в положении на спине и обеспечить лапы пробки борту. Используя высокоточные ножницы или типсы удалить кожу ноги от ноги до колена, чтобы разоблачить всю длину голени и голени передней.Используйте ножницы, чтобы сделать разрез между голени и голени передней. Используйте типсы, чтобы тщательно удалить слой эпимизия с поверхности мышцы. На лодыжке, использовать миппы, чтобы изолировать переднее сухожилие голени от других сухожилий и осторожно подтянуть на сухожилие, чтобы изолировать его от голени и окружающих мышц.Когда tibialis передней части живота полностью отделены провести сухожилия так, что только проксимальная часть голени передней мышцы прилагается к колену. И аккуратно разорвать проксимальное сухожилие как можно ближе к коленной чашечке. Поместите tibialis передней на кусок марли слегка смоченной солевым раствором, чтобы избежать высыхания.Частично окуните стакан, содержащий от 70 до 100 миллилитров изопентанов, в контейнер с жидким азотом до тех пор, пока изопентан на дне стакана не станет белым твердым. Тщательно предварительно обозначить другую сторону пробки, так что биопсия может быть правильно определены после замораживания, и добавить примерно 0,5 миллилитров трагакантовой резинки на 20 на 11 на 8 миллиметров круговой кусок пробки. Используйте типсы для встраивания голени передней в десен дистального сухожилия вверх.Удерживая мышцу своей оси перпендикулярно поверхности пробки. По крайней мере половина сухожилия стороне голени передней должны оставаться обнаружены резинки. Затем быстро окунуть пробку со встроенной мышцы в охлажденный, размороженный изопентан в течение примерно двух минут, чтобы обеспечить полное замораживание.Получить разделы замороженных тканей, установить температуру криостата до минус 25 градусов по Цельсию и использовать оптимальное соединение температуры резки, чтобы исправить ткани на криостат резки блока. Обрежьте образец до тех пор, пока мышечный живот не будет достигнут. Получить от семи до 10 микрометров разделов сбора по крайней мере две секции на стеклянную горку размещения слайдов при комнатной температуре, как разделы захвачены.Разрешить ткани высохнуть, по крайней мере 20 минут при комнатной температуре в проветриваемой среде. Затем храните раздел при температуре минус 80 градусов по Цельсию, пока они не окрашивают. Иммунолабель тканей.Во-первых, оттаивать горки при комнатной температуре не менее 15 минут в проветриваемой среде. Далее очерчиваем секции гидрофобной ручкой. Исправить ткани с 2%paraformaldehyde в течение 10 минут во влажной камере.В конце фиксации промыть секции с двумя 5 минут моет в свежем PBS за стирку. Блокируйте любую неспецифическую привязку с 10%goat сывороткой, разбавленной в PBS. Через 1 час при комнатной температуре этикетку секций с первичными антителами, представляющими интерес, разбавляют в 5%козлиной сыворотке в течение 2 часов при комнатной температуре.В конце инкубации, промыть слайды с тремя 5 минут моет в PBS следовать маркировки с соответствующим флюорофором конъюгированных вторичных антител в течение 45 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть горки с тремя 10 минут моет в PBS. Намонтировать секцию с флуоресцентной крепления среды, содержащей 100 нанограмм на миллилитр DAPI и крышка скольжения.Затем высушите горки на ночь при четырех градусах цельсия перед визуализацией. Tibialis передние мышцы из четырех недель mdx мышей часто отображают неоднородные профили в том числе плохо пострадавших районах в вырождающихся и регенерирующих областях вместе в том же поперечном сечении. Не затронутые слегка пораженные мышечные области содержат миофиберы большого и однородного размера и ядра при низкой плотности, которые в основном расположены на периферии или между миофиберами.IgG положительные миофиберы, как правило, отсутствуют в таком здоровье или слегка пострадавших районах в то время как IgG иммунореактивности в миофиберов указывает на мионекроз. Недавно сформированные миофиберы присутствуют на небольших размерах на ранних стадиях регенерации, постепенно увеличиваясь по мере того, как мышечные прародители сливаются в синцитиальной клетке. Во время этого процесса, myonuclei остаются в центре регенерирующих тканей с кластерами малых, централизованно nucleated миофиберов, указывающих недавно регенерированных миофиберов, чтобы свести к минимуму риск артефактов важно держать в мышцах прямо при замораживании ткани и при правильной температуре.Isopentane и PFA всегда должны быть обработаны с осторожностью и под капотом дыма.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Подготовка и использование Phantom Поражения к практике изобразительного Биопсия Стремление иглы

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo оценке сократимости, утомляемость и аНегпапз в изолированных скелетных мышц

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Оценка функции мышц-разгибателей мышц пальцев Longus<em&gt; EX VIVO</em&gt; И передней большеберцовой мышцы<em&gt; В месте</em&gt; У мышей

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Генерация Myospheres Из ЭСК эпигенетическими Перепрограммирование

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Метилнитрозомочевины (МНУ) -индуцированных дегенерации сетчатки и регенерации в данио рерио: гистологические и функциональные характеристики

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Обнаружение бактерий, резидентов тканей в биопсии мочевого пузыря 16S rRNA Флуоресценция В ситу гибридизации

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Изолировать миофибрили от биопсии скелетных мышц и определения контрактильной функции с помощью нано-ньютоновского разрешения силы трансдуцера

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Изоляция желудочковых кардиомиоцитов человека от ломтиков миокарда вибромы

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Коллекция скелетных биопсий мышц из Высшего отсека человеческого мускулуса Tibialis перед механической оценкой

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Один анализ культуры миофибры для оценки функциональности взрослых мышечных стволовых клеток Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...