Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la Asociación Francesa contre les Myopathies con el programa Translamuscle. Los autores agradecen al Dr. Perla Reyes-Fernandez y al Dr. Matthew Borok por su cuidadosa lectura del manuscrito.

Los experimentos se realizaron de conformidad con la legislación francesa y comunitaria (número de licencia 11-00010).
1. Preparación de las encías tragacanth
<ol><li>En un vaso de precipitados de vidrio, disolver 6 g de polvo de tragacanth en 100 ml de agua desionizada. Cubrir con papel de aluminio y dejar durante al menos 3 h. Revuelva ocasionalmente manualmente con una espátula metálica a medida que la mezcla se vuelve rápidamente viscosa.</li>
	<li>Dejar la mezcla de tragacanto a ...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

La necrosis de miofibra es una consecuencia común del ejercicio traumático en los músculos normales. Está bien compensado por una poderosa capacidad regenerativa de los progenitores musculares locales. Sin embargo, en varias condiciones musculares como en los D, la capacidad regenerativa de las células satélite se ve comprometida por la mionecrosis crónica y la fibrosis excesiva. Los hallazgos recientes muestran que las fibras musculares pueden morir por necroptosis, una forma regulada de necrosis. Más específic...

El músculo esquelético estriado consiste principalmente en fibras musculares (miofibers), que son responsables de la característica función contráctile voluntaria. Estas células son estructuras multinucleadas y postmitoticas que soportan el estrés mecánico que ocurre durante la contracción. La estabilidad estructural de la membrana de la miofiber (sarcolemma) y su matriz extracelular son cruciales para la homeostasis tisular. Las células satélite comprenden la población principal de progenitores musculares en el músculo esquelético maduro y existen en un estado de reposo en músculos sanos. Después de la muerte de la miofibra, la regeneración muscular es apoyada por células satélite después de un programa miogénico que implica activación de células satelitales, proliferación, diferenciación y fusión para, en última instancia, formar nuevas miofibers multinucleadas.
La miofibra la muerte puede ocurrir en múltiples condiciones musculares, incluyendo trauma mecánico, lesiones de isquemia-reperfusión, o distrofias musculares, y se asocia con la morfología necrótica de las células muertas1,2. La muerte necrótica se caracteriza por la rápida permeabilidad de la membrana plasmática y la liberación del contenido celular en el compartimiento extracelular3. Puede ser el resultado de un proceso no regulado que no implica señalización celular adecuada (es decir, necrosis accidental), o de una vía intracelular orquestada (es decir, necrosis regulada). En la miofibras, tanto los procesosregulados 4 comolos 5 no regulados pueden conducir a la necrosis. Una consecuencia típica de la mionecrosis es la liberación de patrones de moléculas asociadas al daño, activando una potente respuesta inflamatoria6. La presencia de macrófagos se observa alrededor de 48 h y 72 h después de una lesión7. Además de su papel en el aclaramiento de escombros necróticos, también son importantes en la regeneración muscular8,9.
Las distrofias musculares (MID) son un grupo heterogéneo de patologías que a menudo resultan de un defecto en la estructura del sarcolemma. La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad juvenil ligada al X que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 nacimientos masculinos en todo el mundo10,y es causada por la ausencia de expresión de distrofina en el sarcolemma. La degeneración crónica del tejido muscular en los niños DMD conduce a la debilidad muscular extrema y la mortalidad temprana. La inflamación resultante de la muerte necrótica mejora la citotoxicidad, y promueve la fibrosis muscular y la pérdida de la función muscular11,12. Se espera que los tratamientos actualmente en ensayos clínicos dirigidos a las raíces de los trastornos degenerativos musculares, como la terapia génica, alivien la mionecrosis. Por lo tanto, se necesitan técnicas simples para cuantificar con precisión la degeneración muscular.
Varios métodos se utilizan rutinariamente para controlar la pérdida de miofibra in vivo. La medición de la actividad enzimática de la creatina quinasa (CK) en la sangre permite una cuantificación fiable de la necrosis continua en los tejidos musculares y cardíacos. In situ, la tinción de hemexilina y eosina (H&E) es el método más popular que se utiliza actualmente en el diagnóstico para evaluar la remodelación de la degeneración-regeneración. Sin embargo, la base molecular del etiquetado H&E de las células muertas sigue sin estar clara. Además, las modificaciones de color que sugieren la muerte de miofibra en la tinción de H&E son relativamente sutiles y no facilitan la cuantificación fiable y reproducible. Métodos que revelan la fragmentación del ADN, como el etiquetado terminal de desoxinucleorden de la transferencia dUTP (TUNEL), etiqueta imperfectamente la muerte necrótica3. También están mal adaptados para monitorear la muerte de células sincitiales como la miofibras. La inyección de tintes vitales, como el tinte azul (EBD) de Evan, representa una alternativa útil para evaluar las miofibers que han perdido la integridad del sarcolemma, pero no es necesariamente conveniente en algunos protocolos experimentales. Por ejemplo, la presencia de EBD en muestras de sangre puede afectar a los resultados de las mediciones de CK, un ensayo colorimétrico. Además, la ingesta intracelular de EBD dificulta el co-inmunoetiquetado. Por lo tanto, un método alternativo que permite el etiquetado directo de miofibers sometidos a necrosis es de interés.
El mecanismo de acción de los tintes vitales se basa en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática en las miofibers necróticas y la aceptación pasiva del tinte inyectado. Del mismo modo, las miofibers necróticas toman proteínas de la sangre como la albúmina, para la que EBD tiene una fuerte afinidad13,14,inmunoglobulina G (IgG) e IgM15. Por lo tanto, la presencia anormal de proteínas sanguíneas dentro de las miofibers representa marcadores convenientes para la mionecrosis in situ. La tinción de estas proteínas puede ser una alternativa para el uso de colorantes vitales.
Mediante el uso de la ingesta de IgG como un marcador de mionecrosis in situ, este protocolo se utiliza para evaluar la degeneración muscular en los tibialis anterior (TA) de ratones con deficiencia de distrofina mdx. Este método presenta ventajas significativas sobre las técnicas alternativas: 1) es reproducible y simple en su ejecución; 2) no requiere ningún tratamiento animal antes de la recolección muscular, como la inyección de dedos vitales circulantes, y 3) como cualquier inmunoetiquetado convencional, es compatible con el etiquetado cooperativo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

La necrosis de las fibras musculares (mionecrosis) desempeña un papel central en la patogénesis de varias afecciones musculares, incluyendo distrofias musculares. Se espera que las opciones terapéuticas que abordan las causas de la patogénesis de la distrofia muscular alivien la degeneración muscular. Por lo tanto, se necesita un método para determinar y cuantificar el alcance de la muerte celular en las biopsias musculares. Los métodos convencionales para observar la degeneración de la miofibra in situ son poco cuantitativos o dependen de la inyección de distos vitales. En este artículo, se describe un protocolo de inmunofluorescencia que mancha las miofibers necróticas al atacar la admisa de inmunoglobulina G (IgG) por miofibers. El método de admisión de IgG se basa en características celulares que caracterizan la muerte necrótica, incluyendo 1) la pérdida de integridad de la membrana plasmática con la liberación de patrones moleculares asociados al daño y 2) la adopción de proteínas plasmáticas. En las secciones transversales murinas, el co-inmunoetiquetado de miofibers, proteínas de matriz extracelular e IgG de ratón permite una identificación limpia y directa de las miofibers con el destino necrótico. Este método simple es adecuado para el análisis cuantitativo y aplicable a todas las especies, incluidas las muestras humanas, y no requiere la inyección de tinte vital. La tinción de miofibers necróticas por la suación de IgG también se puede emparejar con otro co-inmunoetiquetado.

Las miofibers están rodeadas por una matriz extracelular que contiene laminina. La tinción roja delimita la periferia de miofibras y permite su identificación. IgG se muestra en verde. Los núcleos se tiñen con DAPI y se encuentran en azul bajo el microscopio. Sin embargo, los núcleos se muestran en blanco aquí (Figura 1). Se espera una inmunoreactividad IgG débil en el compartimento extracelular, que puede aumentarse en caso de inflamación. La tinci?...

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Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Aquí se describe un protocolo para el inmunoetiquetado directo de miofibers necróticas en criosecciones musculares. Las células necróticas son permeables a las proteínas séricas, incluyendo la inmunoglobulina G (IgG). Revelar la aceptación de IgG por miofibers permite la identificación y cuantificación de miofibers que sufren necrosis independientemente de la condición muscular.

Inmunoetiquetado Desgeneración de miofibra en biopsias musculares

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

La necrosis miofífica es característica de múltiples trastornos neuromusculares y desempeña un papel central en la patogénesis. Un método específico y confiable para evaluar la degeneración muscular es importante para el diagnóstico y la investigación traslacional. Esta técnica extremadamente adaptable permite el etiquetado de múltiples antígenos al mismo tiempo en la misma sección dentro de esa miofibras.Es posible con tintes vitales. La tinción de H&E es un método empírico que no es adaptable para una conjugación fiable y reproducible. La tinción por absorción de IgG, sin embargo, es específica para las células musculares necróticas y aplicable a las biopsias humanas.Esta técnica puede proporcionar información sobre todos los trastornos neuromusculares caracterizados por mionecrosis. Después de quitar el pelo de la pierna de interés colocar el animal mdx macho de cuatro semanas de edad en la posición supina y asegurar las patas a una tabla de corcho. Usando tijeras de precisión o fórceps, retire la piel de la pierna desde el pie hasta la rodilla para exponer toda la longitud de la tibia y tibialis anterior.Utilice las tijeras para hacer una incisión entre la tibia y los tibialis anteriores. Utilice fórceps para eliminar cuidadosamente la capa de epimysium de la superficie del músculo. En el tobillo, usa los fórceps para aislar el tendón anterior de los tibialis de los otros tendones y tira suavemente hacia arriba en el tendón para aislarlo de la tibia y los músculos circundantes.Cuando el vientre anterior tibialis se ha separado por completo, sostenga el tendón hacia arriba de modo que sólo la parte proximal del músculo anterior tibialis se une a la rodilla. Y corta suavemente el tendón proximal lo más cerca posible de la rótula. Coloque los tibialis anteriores sobre un trozo de gasa ligeramente humedecido con solución salina para evitar el secado.Sumergir parcialmente un vaso de precipitados que contenga de 70 a 100 mililitros de isopentano en un recipiente de nitrógeno líquido hasta que el isopentano en la parte inferior del vaso de precipitados se convierta en un sólido blanco. Preetiquete cuidadosamente el otro lado de los corchos para que la biopsia pueda ser identificada correctamente después de la congelación, y agregue aproximadamente 0,5 mililitros de goma de tragacantth en una pieza circular de corcho de 20 por 11 por 8 milímetros. Use fórceps para incrustar los tibialis anteriores en el tendón distal de la encía hacia arriba.Sosteniendo el músculo con su eje perpendicular a la superficie del corcho. Al menos la mitad del lado del tendón de la tibialis anterior debe permanecer descubierto por la encía. A continuación, sumerja rápidamente el corcho con el músculo incrustado en el isopentano frío y sin congelar durante unos dos minutos para permitir la congelación completa.Obtener secciones del tejido congelado, ajustar la temperatura del criostato a menos 25 grados Celsius y utilizar un compuesto de temperatura de corte óptima para fijar el tejido en el bloque de corte de criostato. Recorte la muestra hasta que se alcance el vientre muscular. Obtenga de siete a 10 secciones de micrómetros que recojan al menos dos secciones por diapositiva de vidrio colocando los portaobjetos a temperatura ambiente a medida que se capturan las secciones.Deje que los tejidos se sequen durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente en un ambiente ventilado. A continuación, guarde la sección a menos 80 grados Celsius hasta que estén manchando. Inmunoetique los tejidos.En primer lugar, descongele los portaobjetos a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos en el ambiente ventilado. A continuación, delinear las secciones con una pluma hidrófoba. Fijar los tejidos con 2%paraformaldehído durante 10 minutos en una cámara húmeda.Al final de una fijación enjuague las secciones con dos lavados de 5 minutos en PBS fresco por lavado. Bloquear cualquier unión no específica con 10% de suero de cabra diluido en PBS. Después de 1 hora a temperatura ambiente etiquetar las secciones con un anticuerpo primario de interés, diluido en 5%suero de cabra durante 2 horas a temperatura ambiente.Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos con tres lavados de 5 minutos en PBS siguiendo mediante el etiquetado con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados durante 45 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Al final de la incubación, lave los portaobjetos con tres lavados de 10 minutos en PBS. Monte la sección con un medio de montaje fluorescente que contenga 100 nanogramos por mililitro de DAPI y un resbalón de cubierta.Luego seque los portaobjetos durante la noche a cuatro grados Celsius antes de tomar imágenes. Los músculos anteriores de Tibialis de ratones mdx de cuatro semanas de edad a menudo muestran perfiles heterogéneos, incluyendo áreas mal afectadas en áreas degenerantes y regeneradoras juntas en la misma sección transversal. No afectados a las áreas musculares levemente afectadas contienen miofibers de un tamaño grande y homogéneo y núcleos a baja densidad que se encuentran principalmente en la periferia o entre miofibras.Las miofibras igg positivas generalmente están ausentes en dicha salud o en áreas levemente afectadas, mientras que la inmunorreactividad IgG dentro de los miofibers indica mionecrosis. Los miofibers recién formados están presentes en un tamaño pequeño en sus primeras etapas de regeneración progresivamente agrandando a medida que los progenitores musculares se fusionan en contribuir a la célula sincitial. Durante este proceso, los mionúcleos permanecen en el centro del tejido regenerador con racimos de miofibres pequeños, centralmente nucleados que indican miofibers recientemente regenerados Para minimizar el riesgo de artefactos es importante mantener en los músculos rectos al congelar el tejido y a la temperatura correcta.El isopentano y la PFA siempre deben manipularse con precaución y bajo una campana de humo.

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