Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Detta arbete stöddes av föreningen française contre Les Myopathies med Translamuscle programmet. Författarna tackar Dr Perla Reyes-Fernandez och Dr Matthew Borok för deras noggranna läsning av manuskriptet.

Experiment utfördes i enlighet med den franska och Europeiska gemenskapens lagstiftning (licensnummer 11-00010).
1. tragacanth tuggummi beredning
<ol><li>Lös 6 g dragant pulver i en glasbägare i 100 ml avjoniserat vatten. Täck med folie och låt verka i minst 3 h. ibland rör om manuellt med en metallspatel som blandningen snabbt blir trögflytande.</li>
	<li>Lämna dragant blandningen vid 60 ° c över natten i ett vattenbad eller i ugnen. Försegla bägaren noggrant för att undvika ut...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Myofiber nekros är en vanlig följd av traumatisk övning i normala muskler. Den är väl kompenserad av en kraftfull regenerativ kapacitet hos de lokala muskel progenitorerna. Emellertid, i flera muskel tillstånd som i MDs, regenerativ kapacitet av satellit celler äventyras av kronisk myonecrosis och överdriven fibros. De senaste rönen visar att muskelfibrer kan dö genom nekroptos, en reglerad form av nekros. Mer specifikt kan hämning av necroptos bli en ny terapeutisk strategi för DMD behandling<sup class="xref...

Tvärstrimmig skelettmuskulaturen består huvudsakligen av muskelfibrer (myofibers), som är ansvariga för den karakteristiska frivilliga kontraktila funktion. Dessa celler är multinucleated, post-mitotiska strukturer som stöder mekanisk stress inträffar under kontraktion. Strukturell stabilitet av myofiber membranet (sarcolemma) och dess extracellulära matris är avgörande för vävnad homeostas. Satellit celler utgör den viktigaste muskeln stamfader i mogna skelett muskler och finns i en quiescent tillstånd i friska muskler. Efter myofiber död, muskel förnyelse stöds av satellit celler efter en Myogenic program som involverar satellit cell aktivering, proliferation, differentiering, och fusion att slutligen bilda nya flerkärniga myofibers.
Myofiber nedläggningen kan förekomma i flera muskel förhållanden, inklusive mekaniska trauma, ischemia-reperfusion skador, eller muskeldystrophies, och det är förknippat med den nekrotiska morfologin av döda celler1,2. Nekrotisk död kännetecknas av den snabba permeabiliteten i plasmamembranet och frisättning av cellinnehåll i extracellulära facket3. Det kan bero på antingen en oreglerad process som inte innebär någon ordentlig cellsignalering (dvs. oavsiktlig nekros), eller en orkeslerad intracellulär väg (dvs., reglerad nekros). I myofibers, både reglerade4 och oreglerade5 processer kan leda till nekros. En typisk följd av myonecrosis är frisläppandet av skadeassocierade molekyl mönster, aktivera ett kraftfullt inflammatoriskt svar6. Närvaron av makrofager observeras vid cirka 48 h och 72 h efter skada7. Förutom sin roll i clearance av nekrotisk skräp, de är också viktiga i muskel förnyelse8,9.
Muskeldystrofier (MDs) är en heterogen grupp av patologier som ofta beror på en defekt i sarcolemma struktur. Duchennes muskeldystrofi (DMD) är en juvenil X-länkade sjukdom som drabbar cirka 1 av varje 3 500 manliga födslar över hela världen10, och det orsakas av frånvaron av dystrofin uttryck vid sarcolemma. Kronisk degeneration av muskelvävnad i DMD pojkar leder till extrem muskelsvaghet och tidig dödlighet. Inflammation till följd av nekrotisk död ökar cytotoxicitet, och främjar muskel fibros och förlusten av muskelfunktion11,12. Behandlingar som för närvarande i kliniska prövningar som riktar sig till rötterna av muskel degenerativa sjukdomar, såsom genterapi, förväntas lindra myonecrosis. Enkla tekniker för att exakt kvantifiera muskel degeneration behövs därför.
Flera metoder används rutinmässigt för att övervaka myofiber förlust in vivo. Mätningen av den enzymatiska aktiviteten av kreatinkinas (CK) i blodet möjliggör tillförlitlig kvantifiering av pågående nekros i muskel-och hjärtvävnad. In situ, den hematoxylin och eosin (H & E) färgning är den mest populära metoden som för närvarande används i diagnosen för att bedöma degeneration-Regeneration Remodelling. Den molekylära grunden för H & E-märkningen av döda celler är dock fortfarande oklar. Dessutom, färgändringar tyder myofiber död i H & E färgning är relativt subtila och inte underlättar tillförlitlig och reproducerbar kvantifiering. Metoder som avslöjar DNA-fragmentering, såsom terminalen deoxynucleotidyltransferas dUTP Nick end märkning (TUNEL), ofullständigt etikett nekrotisk död3. De är också dåligt anpassade för att övervaka död syncytial celler såsom myofibers. Injektionen av vitala färgämnen, såsom Evan ' s Blue Dye (EBD), representerar ett användbart alternativ för att bedöma myofibers som har förlorat integriteten av sarcolemma, men är inte nödvändigtvis bekvämt i vissa experimentella protokoll. Till exempel kan närvaron av EBD i blodprov påverka resultaten av CK-mätningar, en kolorimetrisk analys. Dessutom gör intracellulärt upptag av EBD Co-immunolabelling utmanande. Därför är en alternativ metod som möjliggör direkt märkning av myofibers som genomgår nekros av intresse.
Verkningsmekanismen av vitala färgämnen förlitar sig på förlusten av plasmamembranet integritet i nekrotiska myofibers och passiv upptag av det injicerade färgämnet. Likaså, nekrotiska myofibers upptag blodproteiner såsom albumin, för vilka EBD har en stark affinitet13,14, immunglobulin G (IgG), och IgM15. Den onormala närvaron av blodproteiner inom myofibers representerar därför bekväma markörer för myonecrosis in situ. Färgning dessa proteiner kan vara ett alternativ för användning av vitala färgämnen.
Genom att använda IgG upptag som markör för myonecrosis in situ, detta protokoll används för att bedöma muskel degeneration i tibialis anterior (TA) av MDX Dystrophin-bristfällig möss. Denna metod ger betydande fördelar jämfört med alternativa tekniker: 1) den är reproducerbar och enkel i utförandet; 2) det kräver inte någon djur behandling före muskel uppsamling, såsom injektion av cirkulerande vitala färgämnen, och 3) som en konventionell immunolabelling, det är förenligt med co-märkning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Den nekros av muskelfibrer (myonecrosis) spelar en central roll i patogenesen av flera muskelsjukdomar, inklusive muskeldystrophies. Terapeutiska alternativ som behandlar orsakerna till muskeldystrofi patogenes förväntas lindra muskel degeneration. Därför behövs en metod för att analys och kvantifiera omfattningen av celldöd i Muskelbiopsier. Konventionella metoder för att observera myofiber degeneration in situ är antingen dåligt kvantitativa eller förlita sig på injektion av vitala färgämnen. I denna artikel, en immunofluorescensprotokoll beskrivs som fläckar nekrotiska myofibers genom att rikta immunglobulin G (IgG) upptag av myofibers. IgG upptagnings metoden baseras på Cellegenskaper som kännetecknar nekrotisk död, inklusive 1) förlusten av plasmamembran integritet med frisättning av skadeassocierade molekylära mönster och 2) upptag av plasmatiska proteiner. I murina tvärsnitt, Co-immunolabelling av myofibers, extracellulära matrix proteiner, och mus IgG tillåter ren och enkel identifiering av myofibers med nekrotisk öde. Denna enkla metod lämpar sig för kvantitativ analys och gäller för alla arter, inklusive mänskliga prover, och kräver inte injektion av vitala färgämnen. Färgning av nekrotiska myofibers av IgG upptag kan också paras ihop med andra samtidig immunolabelling.

Myofibers är omgivna av en laminin-innehållande extracellulär matris. Rödfärgning avgränsar myofibers periferi och gör det möjligt för deras identifiering. IgG visas i grönt. Kärnor färgas med DAPI och finns blå under mikroskopet. Kärnor visas dock i vitt här (figur 1). En svag IgG immunoreaktivitet förväntas i det extracellulära facket, som kan ökas i händelse av inflammation. Grönfärgning inom myofibers återspeglar närvaron av IgG.</...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Beskrivs här är ett protokoll för direkt immunolabelling av nekrotiska myofibers i muskel kryosektioner. Nekrotiska celler är permeabla för serumproteiner, inklusive immunglobulin G (IgG). Avslöjar upptaget av IgG av myofibers möjliggör identifiering och kvantifiering av myofibers som genomgår nekros oavsett muskel tillstånd.

Immunolabelling myofiber degeneration i Muskelbiopsier

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Myofiber nekros är karakteristisk för flera neuromuskulära störningar och spelar en central roll i patogenes. En specifik, tillförlitlig metod för att bedöma muskeldegeneration är viktig för diagnos och translationell forskning. Denna extremt anpassningsbar teknik tillåter märkning av flera antigen som samtidigt i samma avsnitt inom det myofibers.Det är möjligt med vitala färgämnen. H&E-färgning är en empirisk metod som inte är anpassningsbar för tillförlitlig och reproducerbar konjugation. IgG upptag färgning, dock, är specifikt för nekrotiska muskelceller och tillämpliga på mänskliga tarmbiopsier.Denna teknik kan ge insikt i alla neuromuskulära sjukdomar som kännetecknas av myonecrosis. Efter att ha tagit bort håret från benet av intresse placera fyra veckor gamla manliga mdx djur i ryggläge och säkra tassarna till en kork styrelse. Med hjälp av precision sax eller tärna bort benet huden från foten till knäet för att exponera hela längden av skenbenet och tibialis främre.Använd saxen för att göra ett snitt mellan skenbenet och tibialis främre. Använd forceps för att försiktigt ta bort epimysiumskiktet från muskelns yta. Vid fotleden, använd tärna för att isolera tibialis främre sena från de andra senor och försiktigt dra upp på senan för att isolera den från skenbenet och de omgivande musklerna.När tibialis främre magen helt har separerat hålla senan upp så att endast den proximala delen av tibialis främre muskeln är fäst vid knäet. Och försiktigt bryta den proximala senan så nära som möjligt till patella. Placera tibialis främre på en bit gasväv lätt dämpad med saltlösning för att undvika torkning.Doppa delvis en bägare som innehåller 70 till 100 milliliter isopentan i en behållare med flytande kväve tills isopentanen i botten av bägaren blir ett vitt fast ämne. Försiktigt företikett den andra sidan av korkarna så att biopsin kan identifieras ordentligt efter frysning, och tillsätt cirka 0,5 milliliter tragacanth tuggummi på en 20 av 11 med 8 millimeter cirkulär korkbit. Använd tes för att bädda in tibialis främre i tandköttet distala sena sida upp.Hålla muskeln med sin axel vinkelrätt mot korkytan. Minst hälften av senan sidan av tibialis främre bör förbli avslöjas av tandköttet. Doppa sedan snabbt korken med den inbäddade muskeln i den kylda, ofrysta isopentanen i ca två minuter för att möjliggöra fullständig frysning.Få delar av den frusna vävnaden, ställ in kryostattemperaturen på minus 25 grader Celsius och använd optimal skärtemperaturförening för att fixera vävnaden på cryostatskärblocket. Trimma provet tills muskelmagen är nådd. Få sju till 10 mikrometersektioner som samlar in minst två sektioner per glasglas som placerar objektglasen i rumstemperatur när sektionerna fångas upp.Låt vävnaderna torka i minst 20 minuter vid rumstemperatur i ventilerad miljö. Förvara sedan sektionen på minus 80 grader Celsius tills de färgar. Immunolabel vävnaderna.Först tina diabilderna i rumstemperatur i minst 15 minuter i den ventilerade miljön. Därefter avgränsar sektionerna med en hydrofoba penna. Fixa vävnaderna med 2%paraformaldehyd i 10 minuter i en fuktig kammare.I slutet av en fixering skölj sektionerna med två 5 minuters tvättar i färska PBS per tvätt. Blockera eventuell icke-specifik bindning med 10%getserum utspätt i PBS. Efter 1 timme vid rumstemperatur etikett de sektioner med en primär antikroppar av intresse, utspädd i 5%get serum i 2 timmar vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, skölj objektglasen med tre 5 minuters tvättar i PBS följa genom märkning med lämplig fluorophore konjugerade sekundära antikroppar i 45 minuter vid rumstemperatur skyddas från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta objektglasen med tre 10 minuters tvättar i PBS. Montera sektionen med ett lysrörsmonteringsmedium som innehåller 100 nanogram per milliliter DAPI och en täcksli.Torka sedan rutschkanorna över natten vid fyra grader Celsius före avbildning. Tibialis främre muskler från fyra veckor gamla mdx möss ofta visa heterogena profiler inklusive dåligt drabbade områden i urarta och regenerera områden tillsammans i samma tvärsnitt. Opåverkad till milt drabbade muskel områden innehåller myofibers av en stor och homogen storlek och atomkärnor vid en låg densitet som huvudsakligen ligger i periferin eller i mellan myofibers.IgG positiva myofibers är i allmänhet frånvarande i sådana hälsa eller lindrigt drabbade områden medan IgG immunoreactivity inom myofibers indikerar myonecrosis. Nybildade myofibers är närvarande i en liten storlek i sina tidiga stadier av regenerering successivt utvidga som muskeln progenitors säkring i bidra till syncytial cellen. Under denna process, myonuklei kvar i mitten av regenererande vävnad med kluster av små, centralt nucleated myofibers som anger nyligen regenererade myofibers För att minimera risken för artefakter är det viktigt att hålla i musklerna rakt när frysning av vävnaden och vid rätt temperatur.Isopentan och PFA ska alltid hanteras med försiktighet och under draghuv.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Upprättande och använda Phantom Lesioner till praktik Fine Biopsier needle aspiration

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Utvärdering av muskelfunktion i extensor digitorum longus-muskeln<em&gt; Ex vivo</em&gt; Och tibialis anterior Muscle<em&gt; In situ</em&gt; I möss

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering av Myospheres Från hESCs genom epigenetiska omprogrammeringen

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea (MNU) -inducerad Retinal Degeneration och Regeneration i Zebrafish: Histologisk och funktionella egenskaper

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Detektion av vävnad bosatt bakterier i urinblåsan biopsier av 16S rRNA Fluorescence in situ hybridisering

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Isolera Myofibrils från skelettmuskulatur tarmbiopsier och bestämma Contractile funktion med en Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Isolering av mänskliga Ventrikulära kardiomyocyter från Vibratome-Cut Myokardial Skivor

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Insamling av skelettmuskulaturbiopsier från det överlägsna facket i Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Single Myofiber Culture Assay för bedömning av vuxna muskelstamcellsfunktionalitet Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...