Name: immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Bu çalışma Translamuscle programı ile Dernek Française contre les Myopathies tarafından desteklenmiştir. Yazarlar dr Perla Reyes-Fernandez ve Dr Matthew Borok onların el yazması dikkatli okuma için teşekkür ederiz.

Deneyler Fransız ve Avrupa Topluluğu mevzuatına (lisans numarası 11-00010) uygun olarak yapılmıştır.
1. Tragacanth sakız hazırlama
<ol><li>Bir cam kabında, 100 mL deiyonize suda 6 g tragacanth tozunu çözün. Folyo ile kaplayın ve en az 3 saat bekletin.</li>
	<li>Tragacanth karışımını bir gece leme 60 °C'de bir su banyosunda veya fırında bırakın. Kurumasını önlemek için kabı dikkatlice kapatın. Aliquoting önce en az bir kez karıştırın.</li>
	<li>Aliquot ve 2...

<ol>
	<li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired.">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li><li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases:+cytochemical+and+immunocytochemical+data.">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Morgan, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+mediates+myofiber+death+in+dystrophin-deficient+mice.">Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 3655 (2018).</li><li>Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+susceptibility+of+EDL+muscles+from+mdx+mice+to+damage+induced+by+contractions+with+stretch.">Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).</li><li>Tidball, J. G., Villalta, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+interactions+between+muscle+and+the+immune+system+during+muscle+regeneration.">Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration.</a> American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).</li><li>Riederer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slowing+down+differentiation+of+engrafted+human+myoblasts+into+immunodeficient+mice+correlates+with+increased+proliferation+and+migration.">Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration.</a> Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).</li><li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis.">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li><li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation.">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li><li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy:+21+years+experience+in+Wales+(UK).">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li><li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle.">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li><li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li><li>Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endpoint+measures+in+the+mdx+mouse+relevant+for+muscular+dystrophy+pre-clinical+studies.">Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+blood-brain+barrier+integrity:+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives?+Frontiers+in+Neuroscience.">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li><li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption.">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+(mdx)+and+normal+muscle+in+the+mouse.">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li><li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy.">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li></ol>

Miyofiber nekrozu normal kaslarda travmatik egzersizin yaygın bir sonucudur. Bu iyi yerel kas atalarının güçlü bir rejeneratif kapasitesi ile telafi edilir. Ancak, MDs gibi çeşitli kas koşullarında, uydu hücrelerinin rejeneratif kapasitesi kronik mionekroz isi ve aşırı fibrozis tarafından tehlikeye. Son bulgular kas liflerinin nekrozun düzenlenmiş bir formu olan nekroz ile ölebileceğini göstermektedir. Daha spesifik olarak, nekroz inhibisyonu DMD tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi haline gelebi...

Striated iskelet kası esas olarak karakteristik gönüllü kontraktil fonksiyon sorumludur kas lifleri (miyofiberler), oluşur. Bu hücreler daralma sırasında meydana gelen mekanik stresi destekleyen çok çekirdekli, post-mitotik yapılardır. Miyofiber membranın yapısal stabilitesi (sarkolemma) ve hücre dışı matriks doku homeostazisi için çok önemlidir. Uydu hücreleri olgun iskelet kası ana kas atası popülasyonunu oluşturur ve sağlıklı kaslarda kin halinde bulunur. Miyofiber ölümden sonra, kas rejenerasyonuydu hücre aktivasyonu içeren bir miyojenik programı takip uydu hücreleri tarafından desteklenir, çoğalma, farklılaşma, ve füzyon sonuçta yeni multinükleli miyofonlar oluşturmak için.
Miyofik ölümü birden fazla kas koşullarında oluşabilir, mekanik travma da dahil olmak üzere, iskemi-reperfüzyon yaralanmaları, veya kas distrofiler, ve ölü hücrelerin nekrotik morfolojisi ile ilişkili1,2. Nekrotik ölüm plazma zarının hızlı geçirgenliği ve hücre dışı kompartmanda hücre içeriğinin serbest bırakılması ile karakterizedir3. Uygun bir hücre sinyali (yani kazara nekroz) içermeyen düzensiz bir süreç ya da düzenlenmiş bir hücre içi yol (yani, düzenlenmiş nekroz) ile sonuçlanabilir. Miyofiberlerde hem düzenlenmiş4 hem de düzensiz5 proses nekrozuna yol açabilir. Mionekrozun tipik bir sonucu, hasarla ilişkili molekül desenlerinin serbest bırakılmasıdır, güçlü bir inflamatuaryanıtıaktive 6. Makrofajların varlığı yaklaşık 48 h ve 72 h yaralanma dan sonra gözlenmektedir7. Nekrotik enkaz temizliği ndeki rollerinin yanı sıra, kas rejenerasyonu8,9da önemlidir.
Kas distrofileri (MDs) genellikle sarkolemma yapısında bir kusur sonucu patolojiler heterojen bir gruptur. Duchenne musküler distrofi (DMD)dünyaçapında her 3.500 erkek doğumdan yaklaşık 1'ini etkileyen x bağlantılı bir hastalıktır ve sarkolemmada distrofin ekspresyonunun olmamasından kaynaklanır. DMD erkek çocuklarda kas dokusunun kronik dejenerasyonu aşırı kas güçsüzlüğü ve erken mortaliteye yol açar. Nekrotik ölüm sonucu inflamasyon sitotoksisite artırır, ve kas fibrozis ve kas fonksiyonu kaybı teşvik11,12. Gen tedavisi gibi kas dejeneratif bozukluklarının köklerini hedefleyen klinik çalışmalarda şu anda tedavilerin mionekroziyi hafifletmesi beklenmektedir. Bu nedenle kas dejenerasyonu doğru bir şekilde ölçmek için basit tekniklere ihtiyaç vardır.
Çeşitli yöntemler rutin in vivo miyofiber kaybını izlemek için kullanılır. Kandaki kreatin kizazın (CK) enzimatik aktivitesinin ölçülmesi kas ve kalp dokularında devam eden nekrozun güvenilir bir şekilde ölçülmesine olanak sağlar. Yerinde, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama şu anda dejenerasyon-rejenerasyon remodelling değerlendirmek için tanı kullanılan en popüler yöntemdir. Ancak, ölü hücrelerin H & E etiketleme moleküler temeli belirsizliğini koruyor. Ayrıca, H & E boyama miyofiber ölüm düşündüren renk modifikasyonları nispeten ince ve güvenilir ve tekrarlanabilir nicelleştirme kolaylaştırmak değildir. Terminal deoksinükleotidyl transferaz dUTP nick uç etiketleme (TUNEL), kusurlu etiket nekrotik ölüm3gibi DNA parçalanması ortaya çıkaran yöntemler. Onlar da kötü miyofibers gibi senytial hücrelerin ölümünü izlemek için adapte edilmiştir. Evan'ın mavi boya (EBD) gibi hayati boyaların enjeksiyonu, sarkolemmanın bütünlüğünü kaybetmiş miyolifleri değerlendirmek için yararlı bir alternatiftir, ancak bazı deneysel protokollerde mutlaka uygun değildir. Örneğin, kan örneklerinde EBD varlığı CK ölçümleri, bir kolorimetrik tahsin sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca, EBD hücre içi alımı co-immunolabelling zorlu hale getirir. Bu nedenle, nekroz geçiren miyofiberlerin doğrudan etiketlenmesine olanak tanıyan alternatif bir yöntem ilgi çekicidir.
Hayati boyaların etki mekanizması nekrotik miyofiberlerde plazma membran bütünlüğünün kaybına ve enjekte edilen boyanın pasif alımına dayanır. Benzer şekilde, nekrotik miyofiberler albümin gibi kan proteinlerini alımı, hangi EBD güçlü bir yakınlık vardır13,14, immünglobulin G (IgG), ve IgM15. Miyolifler içinde kan proteinlerinin anormal varlığı bu nedenle yerinde mionekroz için uygun belirteçleri temsil eder. Bu proteinlerin boyanması hayati boyaların kullanımı için bir alternatif olabilir.
IgG alımını yerinde mionekrozun belirteci olarak kullanarak, bu protokol mdx distrofin eksikliği olan farelerin tibialis anterior (TA) kas dejenerasyonu değerlendirmek için kullanılır. Bu yöntem alternatif teknikler üzerinde önemli avantajlar sunar: 1) çoğaltılabilir ve yürütülmesi basit; 2) bu kas toplama öncesinde herhangi bir hayvan tedavisi gerektirmez, hayati boyalar dolaşan enjeksiyon gibi, ve 3) herhangi bir konvansiyonel immünetiketleme olarak, bu co-etiketleme ile uyumludur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Circular cork disks</td>
			<td>Pyramid Innovation</td>
			<td>R30001-E</td>
			<td>Don&#39;t forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050 sn34</td>
			<td>Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25&#176;C. Thickness:7-10 micrometers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dakopen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td>A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>91117-10</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A32740</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopentane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td>Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mdx mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td>
			<td>Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Imager.D1</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Cellpath</td>
			<td>KMA-0100-00A</td>
			<td>Embedding matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA (Paraformaldehyde)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>28908</td>
			<td>Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>CS3PBS00-01</td>
			<td>Dilution medium for immunolabeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scisors</td>
			<td>FST</td>
			<td>fst 14001-12 and fst 14001-14</td>
			<td>Used for the muscle collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit antibody to mouse pan-Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td>Dilution: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td>Aliquots to keep at +4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunolabelling myofiber degeneration in muscle biopsies

Kas liflerinin nekrozu (mionekrozisi) kas distrofileri de dahil olmak üzere çeşitli kas hastalıklarının patogenezinde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu hafifletmek için kas distrofi patogenezi nedenleri ele terapötik seçenekler bekleniyor. Bu nedenle kas biyopsilerinde hücre ölümünün derecesini hesaplamak ve hesaplamak için bir yöntem gereklidir. Yerinde miyofiber dejenerasyongözlemlemek için geleneksel yöntemler ya kötü kantitatif ya da hayati boyaların enjeksiyonu güveniyor. Bu makalede, immünofloresan protokolü, miyolifler tarafından immünglobulin G (IgG) alımını hedefleyerek nekrotik miyoliflerin lekelerinin nekrotik miyokerruz lar olduğu tanımlanmıştır. IgG alım yöntemi nekrotik ölümü karakterize eden hücre özelliklerine dayanır, dahil 1) hasara bağlı moleküler desenlerin salınımı ile plazma membran bütünlüğünün kaybı ve 2) plazmatik proteinlerin alımı. Murine kesitlerinde, miyoliflerin, hücre dışı matriks proteinlerinin ve fare IgG'nin birlikte immünetiketlemesi miyoliflerin nekrotik kaderle temiz ve anlaşılır bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu basit yöntem kantitatif analiz için uygundur ve insan örnekleri de dahil olmak üzere tüm türler için geçerlidir ve hayati boya enjeksiyonu gerektirmez. IgG alımı ile nekrotik miyofiberlerin boyanması da diğer co-immünlabelling ile eşleşebilir.

Miyofiberler lamina içeren hücre dışı bir matrisle çevrilidir. Kırmızı boyama miyofiberlerin çevresini sınırlar ve kimliklerinin belirlenmesini sağlar. IgG yeşil olarak gösterilir. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve mikroskop altında mavi bulunur. Ancak, çekirdekleri burada beyaz olarak gösterilir (Şekil 1). Zayıf bir IgG immünoreaktivite ekstrasellüler bölmesi bekleniyor, hangi inflamasyon durumunda artabilir. Miyofiberler içinde ye?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies at JoVE.com

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

Burada açıklanan kas kriyokesitlerinde nekrotik miyofiberlerin doğrudan immünolabelling için bir protokoldür. Nekrotik hücreler immünglobulin G (IgG) dahil olmak üzere serum proteinlerine geçirilebilir. Miyofiberler tarafından IgG alımının ortaya çıkması, kas durumuna bakılmaksızın nekroz geçiren miyoliflerin tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak sağlar.

Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Miyofiber nekroz birden fazla nöromüsküler bozukluğun karakteristik özelliğidir ve patogenezde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu değerlendirmek için özel, güvenilir bir yöntem tanı ve çeviri araştırma için önemlidir. Bu son derece uyarlanabilir teknik, aynı bölümde birden fazla antijenin miyofiberler içinde aynı anda etiketlemesine olanak sağlar.Hayati boyalarla mümkündür. H&E boyama, güvenilir ve tekrarlanabilir çekim için uyarlanamayan ampirik bir yöntemdir. IgG alımı boyama, ancak, nekrotik kas hücreleri için özel ve insan biyopsileri için geçerlidir.Bu teknik mionekroz ile karakterize tüm nöromüsküler bozukluklar içine anlayış sağlayabilir. İlgi ayağından saç çıkardıktan sonra supine pozisyonda dört haftalık erkek mdx hayvan yerleştirin ve bir mantar tahtası pençeleri güvenli. Hassas makas veya forceps kullanarak tibia ve tibialis anterior tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için diz ayak bacak deri sini çıkarın.Tibia ve tibialis anterior arasında bir kesi yapmak için makas kullanın. Dikkatle kas yüzeyinden epimysium tabakası kaldırmak için forceps kullanın. Ayak bileğinde, diğer tendondan tibialis anterior tendonu izole etmek için forceps kullanın ve yavaşça tibia ve çevresindeki kaslardan izole etmek için tendon yukarı çekin.Tibialis anterior göbek tamamen böylece tibialis anterior kas sadece proksimal kısmı diz bağlı olarak tendonu tutun ayrılmış zaman. Ve proksimal tendonu patella ya kadar yakın yavaşça ayırın. Kurumasını önlemek için hafifçe tuzlu ile nemlendirilmiş gazlı bez bir parça tibialis anterior yerleştirin.Kabın altındaki isopentane beyaz bir katı haline gelene kadar sıvı nitrojen bir kap içine isopentane 70 ila 100 mililitre içeren bir kabı kısmen batırın. Biyopsi donduktan sonra düzgün bir şekilde tespit edilebilsin diye mantarların diğer tarafını dikkatlice etiketlendirin ve yaklaşık 0,5 mililitre tragacanth sakızı ekleyin ve 20'ye 11'e 8 milimetrelik dairesel bir mantar parçasına ekleyin. Kadar sakız distal tendon tarafına tibialis anterior gömmek için forceps kullanın.Mantar yüzeyine dik ekseni ile kas tutma. Tibialis anterior tendon tarafının en az yarısı sakız tarafından ortaya kalmalıdır. Sonra hızlı bir şekilde soğutulmuş içine gömülü kas ile mantar daldırma, dondurulmamış tam dondurma sağlamak için yaklaşık iki dakika boyunca isopentane.Dondurulmuş doku bölümlerini elde edin, kriyostat sıcaklığını eksi 25 dereceye ayarlayın ve dokuyu kriyostat kesme bloğuna sabitlemek için optimum kesme sıcaklığı bileşiği kullanın. Kas karın ulaşılından önce örnek trim. Bölümler yakalanırken slaytları oda sıcaklığında yerleştirerek cam slayt başına en az iki bölüm toplayan 7 ila 10 mikrometre lik kesitler edinin.Havalandırmalı bir ortamda oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca dokuların kurumasını bekleyin. Sonra bölümü lekeleyene kadar eksi 80 derecede saklayın. Dokuları immunolabel.İlk olarak, havalandırılan ortamda en az 15 dakika oda sıcaklığında slaytları eritin. Daha sonra, hidrofobik kalem ile bölümleri belirtin. Nemli bir odada 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehit ile dokuları düzeltin.Bir fiksasyon sonunda yıkama başına taze PBS iki 5 dakika yıkar ile bölümleri durulayın. PBS'de seyreltilmiş %10 keçi serumu ile spesifik olmayan herhangi bir bağlanmayı engelleyin. Oda sıcaklığında 1 saat sonra ilgi birincil antikorları ile bölümleri etiket, oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 5 keçi serum seyreltilmiş.Kuluçka sonunda, PBS'de üç 5 dakikalık yıkayıcı slaytları durulayın ve ardından ışıktan korunan oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun florofor konjuge ikincil antikorlarla etiketleyin. Kuluçka sonunda, PBS üç 10 dakikalık yıkar ile slaytlar yıkayın. DaPI mililitre başına 100 nanogram ve bir kapak kayma içeren bir floresan montaj ortamı ile bölüm monte.Daha sonra görüntülemeden önce slaytları bir gecede dört derece santigrat derecede kurutun. Dört haftalık mdx farelertibialis anterior kasları genellikle aynı kesitte birlikte dejeneratif ve rejeneratif alanlarda kötü etkilenen alanlar da dahil olmak üzere heterojen profiller görüntüler. Hafif etkilenen kas bölgelerinde etkilenmemiş esas olarak çevre de veya miyofiller arasında bulunan düşük yoğunluklu büyük ve homojen boyutu ve çekirdekleri miyofibers içerir.Miyofiberler içinde IgG immünoaktivite mionekrosisgösterir ise IgG pozitif miyofiberler genellikle bu tür sağlık veya hafif etkilenen bölgelerde yok. Yeni oluşan miyolifler, kas atalarının sinsel hücreye katkıda bulunmasıyla yenilenmenin erken evrelerinde küçük bir boyutta bulunurlar. Bu işlem sırasında, miyokenin küçük kümeleri ile rejenerasyon doku merkezinde kalır, merkezi olarak çekirdekli miyofiberler son zamanlarda yenilenmiş miyofiberler gösteren bu doku dondurma ve doğru sıcaklıkta kaslarda düz tutmak önemlidir.Isopentane ve PFA her zaman dikkatli ve bir duman başlık altında ele alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Hazırlık ve ince iğne aspirasyon biyopsilerinin Pratik Phantom Lezyonlar kullanma

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Ekstansör digitorum longus kas ve kas Fonksiyonunun Değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Ve tibialis anterior kas<em&gt; Yerinde</em&gt; Farelerde

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Methylnitrosourea MNU-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonda 16S rRNA Floresan ile Mesane Biyopsilerinde Doku Dağı Bakterilerin In Salgılanması

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

İskelet Kas Biyopsilerinden Miyofibrillerin İzlenmesi ve Nano-Newton Çözünürlük Transdüseri ile Kontraktil Fonksiyonun Belirlenmesi

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

Vibratome-Cut Miyokardiyal Dilimlerden İnsan Ventriküler Kardiyomiyositlerin İzolasyon

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Mekanik Değerlendirme için İnsan Musculus Tibialis Anterior Üstün Bölmesi İskelet Kas Biyopsileri Toplama

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Yetişkin Kas Kök Hücre İşlevselliğinin Değerlendirilmesi için Tek Miyofiber Kültür Tahlil Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...