Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

ويشكر أصحاب البلاغ باربرا بليكمان على مساعدتها التقنية الممتازة. وقد تم دعم هذه الدراسات من قبل برنامج IFORES التابع لجامعة دويسبورغ- إيسن وكلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن وبرنامج RIMUR التابع لتحالف جامعة روهر ومركز أبحاث ميركاتور رور (MERCUR). ويشكر المؤلفون يورغن - مانشوت - ستيفتونغ على زمالة الدكتوراه التي حصلت عليها هيلين سيرتزنغ وعلى الدعم المستمر. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ-إيسن (14-6028-BO) على جمع واستخدام مواد المرضى.

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما أقرتها لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن (14-6028-BO).
1. جمع عينات الدم أو البول وعزل الحمض النووي فيروس الورم
<ol><li>جمع ما لا يقل عن 3 مل من الدم في أنابيب EDTA أو البول في أنابيب اكتساب.</li>
	<li>الطرد المركزي ?...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

في هذه المقالة، يتم عرض طريقة شائعة الاستخدام تسمح بتحليل منطقة التحكم غير الترميز BKPyV (NCCR) مدفوعة نشاط المروج المبكر والمتأخر. يمكن قياس نشاط NCCR في وقت واحد ولا يحتاج إلى lysis من الخلايا المنقولة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا والمشاركة في نقل علامات إضافية لتطبيع قيم ...

تمثل فيروسات الورم اللامع عائلة مستقلة من فيروسات الحمض النووي المزدوج (dsDNA) الصغيرة التي تقطعت بها السبل مع فيروس سيميان 40 (SV40) كنوع أولي. تحدث العدوى الأولية بشكل رئيسي خلال مرحلة الطفولة، والتي عادة ما تستمر دون أعراض المرض وعادة ما تسبب التهابات كامنة في المضيفين المختصة المناعية. فيروس الورم الحميد BK (BKPyV) يستمر بشكل رئيسي في خلايا الأنابيب الكلوية دون التسبب في أمراض الكلى، ومع ذلك، في حالة ضعف الكفاءة المناعية بعد زرع الكلى يمكن أن يعيد تنشيط الفيروس ويسبب أضرار شديدة وضعف الكسب غير المشروع وظيفة عند الوصول إلى فيرميا عالية (1 × 104 BKPyV نسخ الحمض النووي / مل)1،2. في ما يقرب من 10٪ من متلقي زراعة الكلى، يؤدي إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK (BKPyV) إلى اعتلال الكلى المرتبط بفيروس الورم الحميد (PyVAN)، والذي كان يصل إلى 80٪ المرتبطة بارتفاع خطر فشل الطعوم الكلوية3،4 . وبما أنه لا تتوفر أي عوامل مضادة للفيروسات المعتمدة، يقوم العلاج الحالي على الحد من كبت المناعة. ومن المثير للاهتمام, مثبطات mTOR يبدو أن لها تأثير مضاد للفيروسات; وبالتالي، فإن تحويل العلاج المثبط للمناعة إلى كبت المناعة القائم على mTOR قد يمثل نهجا بديلا لمنع تطور فيرميا BKPyV5،6،7. ومع ذلك، فإن الآلية المضادة للفيروسات المستندة إلى mTOR لا تزال حاليا غير مفهومة بشكل كامل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طرق لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة في التركيزات ذات الصلة سريرياً.
يتكون الجينوم الدائري للBKPyV من حوالي 5 كيلو بايت يؤوي منطقة تحكم غير ترميزية (NCCR) التي تعمل كأصل للنسخ المتماثل وفي الوقت الذي يقوم فيه مروج ثنائي الاتجاه يقود التعبير عن النصوص في مرحلة مبكرة ومتأخرة من الحمض النووي الريبي. منذ تحدث تلقائيا NCCR-إعادة ترتيب، يتم العثور على الحذف، والازدواجية في BKPyV المسببة للأمراض8 وتراكمت بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من PVAN5،9، مقارنة بين archetypical (الوزن) و إعادة ترتيب (ص) NCCR الأنشطة مفيدة لوصف اللياقة البدنية فيروسي ة.
كما هو ملخص في الشكل 1، يصف هذا البروتوكول طريقة شائعة الاستخدام لقياس نشاط النسخ BKPyV NCCR من خلال قياس الفلورة من اثنين من الفلوروفور tdTomato وeGFP أعرب عنها من بلازميد مراسل5، 9،10،11. يتم تنفيذ هذا الإجراء في وجود مستضد T SV40 كبيرة (lTAg)، والذي يسمح لتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة على نشاط NCCR في وقت مبكر ومتأخر بشكل منفصل5. ويحلل هذا التقييم كذلك أثر إعادة الترتيب على نشاط اللجنة الوطنية للامتحانات والمقارنة مع التقارير الوطنية المتعلقة بالموارد المعتمدة في مجال الصدمات الأرضية5و9. مراسل بلازميد يأوي إشارة SV40 في وقت متأخر polyadenylation المصب من كل إطار القراءة المفتوحة فلوروفور لضمان معالجة قابلة للمقارنة وفعالة من كل من النصوص لtdTomato وeGFP، على التوالي. بالمقارنة مع أساليب qRT-PCR القائمة5،12،وهذا النهج القائم على FACS يمثل منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية البديل متوافق منذ عدم وجود بروتوكولات استخراج معقدة لثقافة الخلايا المصابة وليس مكلفة هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لتلطيخ الفلورة المناعية. وعلاوة على ذلك، منذ يتم تحليل كمية محددة من الخلايا الفلورية عن طريق قياس التدفق الخلوي، وتحليل دورة الخلية تثبيط وكلاء ممكن أيضا بطريقة كمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

يمكن أن تسبب الفيروسات المتعددة، مثل فيروس الورم المتعدد BK (BKPyV)، أمراضًا حادة لفي المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. ومع ذلك، بما أن مضادات الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حالياً، فإن هناك حاجة إلى أساليب لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. هنا، تم بناء مراسل الفلورة المزدوجة التي تسمح بتحليل BKPyV غير الترميز السيطرة المنطقة (NCCR) مدفوعة في وقت مبكر ونشاط المروج في وقت متأخر لتحديد تأثير الأدوية المضادة للفيروسات المحتملة على التعبير الجيني الفيروسي عن طريق tdTomato وeGFP التعبير. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق استنساخ التضخيم BKPyV-NCCR التي تم الحصول عليها في هذا البروتوكول بشكل مثالي من الحمض النووي المستمدة من الدم من المرضى الذين زرعوا الكلى المناعية، يمكن تحديد تأثير إعادة ترتيب NCCR على التعبير الجيني الفيروسي. بعد استنساخ التضخيم المشتقة من المريض، تم نقل خلايا HEK293T مع البلازميدات المراسل، وعولجت مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. وفي وقت لاحق، خضعت الخلايا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لقياس متوسط كثافة الفلورة 72 ساعة بعد الانتراب. لاختبار أيضا تحليل الأدوية التي لها دورة الخلية المحتملة تثبيط تأثير, يتم استخدام الخلايا الفلورية فقط وبالتالي. بما أنّ هذا فحص يكون أنجزت في كبيرة [ت] مستضد عبّر عن خلايا, التأثير صدمة من مبكّرة وتعبير متأخّرة يستطيع كنت حللت في طريقة مستقلّة متبادلة.

في هذه التجربة التمثيلية، تم قياس النشاط النسخي الدافع لمنطقة التحكم غير الترميزية من BK-polyoma من خلال قياس التدفق. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مثبط mTOR، والتي يمكن استخدامها لعلاج المرضى بعد إعادة تنشيط BKPyV، لتثبيطه للتعبير الجيني الفيروسي المبكر. ولهذه الغاية، تم استخدا?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

قياس BK-polyomavirus غير الترميز السيطرة المنطقة مدفوعة النشاط النسخي عن طريق قياس التدفق

في هذه المخطوطة، يتم تقديم بروتوكول لإجراء قياس يستند إلى FACS للنشاط النسخي لفيروس الورم الأوب باستخدام خلايا HEK293T المنقولة مع بلازميد مراسل ثنائي الاتجاه يعبر عن tdTomato وeGFP. كما تسمح هذه الطريقة بتحديد تأثير المركبات الجديدة على النسخ الفيروسي بشكل كمي.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

الهدف العام لهذا البروتوكول هو قياس BK-polyomavirus غير الترميز التحكم في المنطقة يحركها نشاط النسخ عن طريق قياس الخلايا الفلورية المزدوجة عن طريق تدفق الخلايا. يمكن أن يسبب فيروس BK-polyoma أمراضًا شديدة في المرضى الذين يعانون من المناعة ، وخاصة في متلقي زراعة الكلى. ومع ذلك، بما أن مكافحة الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حاليًا، فإن الطرق التي تقيس التأثير المحتمل لمكافحة الفيروسات للمركبات الأخرى مطلوبة.تسمح هذه الطريقة لعلماء الفيروسات بتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة التي تؤثر على نشاط النسخ النسخي لفيروس BK-polyomaal الذي تحركه منطقة التحكم غير الترميزية. ويسمح هذا الفحص كذلك بدراسة تأثير إعادة الترتيب على نشاط المروج مقارنة بمناطق التحكم غير الترميزية. وميزة دراسة نشاط المروج الفيروسي مع تقرير الفلوريسين المزدوج هو أنه يمكن تحليل التعبير الجيني المبكر والمتأخر بطريقة مستقلة بشكل متبادل.وعلاوة على ذلك، فإن ثقب الصعب من مخزونات الفيروس والتجارب على المدى الطويل ثقافة الخلايا المعدية ليست ضرورية لأنه يتم تحليل الخلايا المصابة فقط وفلورسنت، كما يمكن دراسة الأدوية الحد من صلاحية الخلية وثقب. يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ إيسن. الخطوة الأولى هي جمع عينات الدم لعزل الحمض النووي لفيروس الورم المتعدد.جمع ما لا يقل عن ثلاثة ملليلتر من الدم في أنابيب اقتناء EDTA. الطرد المركزي العينة في 2, 500 G لمدة 15 دقيقة والماصات البلازما في أنبوب جديد. إعداد 40 ميكرولترات من البروتين SK في أنبوب 1.5 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وإضافة البلازما 400 ميكروليتر عن طريق الأنابيب.عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة استخلاص لطخة الحمض النووي كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. إعداد مزيج الرئيسي ل PCR قبل استخدام زوج التمهيدي A في حجم إجمالي 50 ميكرولترات واستخدام الحمض النووي المعزول سابقا. توزيع 45 ميكروليتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR.إضافة خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المعزول في أنابيب PCR وتشغيل PCR مع ظروف رد الفعل كما هو موضح في الجدول الثالث. كرر الوَحن والامتداد في 35 دورة. للتطبيق المتداخل، استخدم زوج التمهيدي B، مع تضمين مواقع التقييد للاستنساخ.مزيج 10 ميكرولترات من المنتج PCR مع اثنين microliters من ستة أضعاف هلام تحميل صبغة. تحميل 10 ميكرولترات من هذا المزيج على 1.5٪ agarose هلام وتشغيل الجل لمدة 30 دقيقة في 60 milliampere. تصور الجل باستخدام نظام توثيق الأشعة فوق البنفسجية المناسبة.تنقية تضخيم PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استوعب أمبلونات المنقى مع إنزيمات تقييد المؤشر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. كرر خطوات تنقية لتنقية أمبليكونات هضمها.في موازاة ذلك ، هضم أيضا العمود الفقري البلازمي. تحليل العمود الفقري البلازميد هضم على 0.8٪ منخفضة جبل agarose هلام. لا تقم بتشغيل الجل في تيار أعلى من 40 مللي أمبير.تصور شظايا الحمض النووي باستخدام موجة طويلة من الأشعة فوق البنفسجية وقطع عازمة العمود الفقري باستخدام مشرط نظيفة. تجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية الطويلة لأوقات لمنع تلف الحمض النووي. سياج لقطعة من هلام flomel جزء جديد 1.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.سخني العمود الفقري الذي يحتوي على قطعة agarose منخفضة الوضع لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية من أجل إذابة قطعة الجل وخلط كل دقيقتين من قبل دوامة لطيف. يمكن استخدام الجل المذاب مباشرة في الربط. ليغيت العمود الفقري و amplicon هضم باستخدام T4 الحمض النووي ligase بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.بعد إجراء الاستنساخ القياسية، عزل الحمض النووي البلازما. أداء هضم الانزيم تقييد للتحقق من استنساخ إيجابية وتصور شظايا هضم على هلام agarose 1٪. البذور 100، 000 خلايا HEK293T في بئر من 12 بئر لوحة 24 ساعة قبل transfection واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، والحفاظ على الانتشار النشط أثناء transfection.يجب أن تكون الخلايا تقريبا في 80٪ التقاء في transfection. ضع 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصلية المخفضة في أنبوب معقمة وأضف ميكروغرام واحد من كل حمض نووي البلازما المبلغ عنه واخلط بلطف عن طريق الأنابيب. إضافة ثلاثة ميكرولترات من كاشف transfection إلى خليط الحمض النووي ويخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان لمدة 15 دقيقة في 22 درجة مئوية.يُضاف الخليط، ويُسقط من الحكمة إلى البئر ويُوزّع بلطف على البئر. بعد أربع ساعات، استبدل المابير بوسيط جديد يحتوي على عوامل الاختبار والتحكم بالمذيبات. في هذا المثال، تم استخدام مثبطات mTOR INK-128 و rapamycin.احتضان في 37 درجة مئوية حتى التحليل. تحقق من الخلايا من الفلورس الأحمر والأخضر تحت مجهر الفلوريسين. الفلورس الأحمر والأخضر تتوافق مع التعبير الجيني BK-polyomavirus في وقت مبكر وأواخر على التوالي.72 ساعة بعد transfection ، نطمح بعناية فائقة. غسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. أضف بلطف 500 ميكرولترات التربسين وتحويل لوحة قليلا لتجنب انفصال سابق لأوانه من الخلايا.هذه الخطوة هامة لتجنب doublets الخلية. بعد إضافة, تتم إزالة التربسين مباشرة مع نفس تلميح ماصة. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق على الأقل في 37 درجة مئوية.إعادة تعليق الخلايا التربسين S مع برنامج تلفزيوني ملليلتر واحد يحتوي على 3٪ FCS ونقل التعليق في أنابيب FACS المسمى مسبقا. يضاف DAPI بتركيز ميكروغرام واحد لكل ملليلتر قبل تحليل FACS. تحليل الخلايا باستخدام مقياس تدفق الخلايا.لكل عينة، قياس ما لا يقل عن 10،000 الخلايا الحية. التعويض الأولي ضروري للتمييز بين الإشارات الحمراء والخضراء لتحقيق نتائج دقيقة. تم تضخيم ريجنت التحكم غير الترميز باستخدام بروتوكول PCR متداخلة باستخدام زوج التمهيدي الداخلي الذي يضم مواقع تقييد الاستنساخ.تم إجراء التحقق من أمبيرليكون عن طريق electrophoresis هلام agarose بينما امبريكون المستمدة من تسلسل NCCR النمطية في توزيع حجم متجانس في الجل، تلك المستمدة من NCCRs إعادة ترتيبها مع الإدراج والحذف، تختلف في حجمها. وتم التحقق من اختيار النسخ الموجبة التي تحتوي على اللجنة الوطنية المعنية بالكرات والاخاءات بواسطة تحليل القيود. تم استبدال منطقة المساحة الصغيرة بشظايا NCCR أكبر تشير إلى استنساخ إيجابي.تم إرسال الحمض النووي Plasmid معزولة عن استنساخ التحقق من ل pyrosequencing. في هذا المثال، تم الكشف عن الحذف في كتلة P و الاستبدال في كتلة O. وقد تم إصابة خلايا HEK293T بشكل عابر مع احترام البناء القابلة للإبلاغ وتم رصد نشاط NCCR بواسطة مجهر الفلورس.تطابقت الفلورسنتات الحمراء والأخضر مع التعبير الجيني لفيروس BK-polyoma في وقت مبكر وأواخر على التوالي. عرضت اللجنة الوطنية الأولى التعبير الجيني المتأخر القوي في حين كان المثال الثاني قوي نسبياً في وقت مبكر ولكن معتدل من التعبير الجيني. تم اغدخل الخلايا السلبية DAPI وتم إنشاء مؤامرة نقطة تظهر eGFP مقابل tdTomato.وقد أدرجت في التحليل عينات كانت سلبية وكذلك تلك العينات الإيجابية لـ tdTomato أو eGFP. تم اشتقاق شدة الفلورس المتوسط من كل استنساخ اختبار. في هذا المثال، والعلاج مع مثبطات MTOR المزدوج INK128 خفضت بشكل كبير tdTomato MFI مما يعني أن التعبير المبكر تم تثبيط.تسمح هذه الطريقة لتحديد المركبات المستخدمة حاليًا وغيرها من المركبات للكشف عن فيروس BK-polyomavirus من خلال النشاط النسخي. في التعبير الجيني المبكر ، وهذا يحدد بالتأكيد الآثار الفيروسية. ويمكن اعتبار قطرات المثبطة لاستخدامها وكلاء للمرضى المناعيين في حالة إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

الخلية على أساس فحوصات للكشف التي يمكن أن تعزز على وجه التحديد مرناً الترجمة غير الترميز سينيوب

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

استخدام القناصة-Cas9 إلى أدنى حد من آثار خارج الهدف كريسبر-Cas9 دون فقدان النشاط على الهدف عن طريق التطور الموجه

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...