Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takker Barbara Bleekmann for fremragende teknisk assistance. Disse undersøgelser blev støttet af IFORES-programmet for universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet for University Alliance Ruhr og Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for det ph. d.-stipendium, som Helene Sertznig og den konstante støtte har. Indsamlingen og anvendelsen af patientmateriale er blevet godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet ved universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Denne protokol følger de retningslinjer for menneskelig forskning, som er godkendt af Ethic Committee af det medicinske fakultet ved universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. indsamling af blod-eller urinprøver og isolering af Polyomavirus DNA
<ol><li>Saml mindst 3 mL blod i EDTA-rør eller urin i erhvervelses rørene.</li>
	<li>Prøven centrifugeres ved 2.500 x g i 15 minutter. Hvis det er nødvendigt, skal du pipettere plasmaet i et nyt rør og opbevare plasmaprøverne ved...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

I denne artikel præsenteres en almindeligt anvendt metode, der giver mulighed for analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan måles samtidigt og behøver ikke lyse af de transficeret celler. Desuden kan et relativt stort antal celler analyseres og co-transfection af yderligere markører for normalisering af fluorescens værdier er ikke nødvendig.
En kritisk del af denne metode er, at den klonede nccr bør indeholde nøjagti...

Polyomaviruser repræsenterer en uafhængig familie af små dobbeltstrenget DNA (dsDNA) vira med Simian virus 40 (SV40) som en prototype art. Den primære infektion opstår hovedsageligt i barndommen, som normalt fortsætter uden sygdomssymptomer og normalt forårsage latente infektioner i immunkompetente værter. BK-Polyomavirus (BKPyV) fortsætter hovedsageligt i renale tubuli celler uden at forårsage nefropatologier, men i tilfælde af svækkelse af immun-kompetence efter nyretransplantation virus kan genaktivere og forårsage alvorlige skader og nedsat transplantat Når der opnås en høj observeres (1 x 104 bkpyv DNA-kopier/ml)1,2. Hos ca. 10% af Nyretransplanterede patienter, reaktivering af BK-Polyomavirus (bkpyv) resulterer i en Polyomavirus associeret nefropati (pyvan), som var op til 80% forbundet med en høj risiko for renal allograft fejl3,4 . Da der ikke findes godkendte antivirale midler, er den aktuelle behandling baseret på reduktion af immunsuppression. Interessant, mTOR-hæmmere synes at have en antiviral effekt; således, at skifte den Immunsuppressive behandling til MTOR-baseret immunsuppression kan repræsentere en alternativ tilgang til at forhindre progression af bkpyv observeres5,6,7. Men den mTOR-baserede antiviral mekanisme er i øjeblikket stadig ufuldstændigt forstået. Der kræves således metoder til måling af virkningen af potentielle antivirale stoffer i klinisk relevante koncentrationer.
Bkpyv's cirkulære genom består af ca. 5 KB, der harkedeligt et ikke-kodende kontrolområde (NCCR), som fungerer som et udgangspunkt for replikation og samtidig en tovejs promotor, som kører ekspressionen af tidlige og sene fase mRNA-udskrifter. Da spontant forekommende nccr-rearrangementer, sletninger og duplikationer findes i patogene bkpyv8 og signifikant akkumuleret hos patienter, der lider af pvan5,9, en sammenligning af arketetypiske (WT) og omarrangerede (RR) NCCR-aktiviteter er nyttige til at karakterisere viral replikerende fitness.
Som opsummeret i figur 1beskriver denne protokol en almindeligt anvendt metode til at måle BKPyV NCCR transkriptional aktivitet ved at kvantificere fluorescensen af to fluorophores tdTomato og egfp udtrykt fra en reporter plasmid5, 9,10,11. Proceduren udføres i nærværelse af SV40 store T-antigen (lTAg), som gør det muligt at analysere virkningen af potentielle antivirale midler på den tidlige og sene NCCR-aktivitet separat5. Denne analyse analyserer yderligere virkningen af rearrangementerne på nccr-aktiviteten og sammenligningen med WT-nccrs5,9. Reporter plasmid huser det SV40 sene polyadenyleringssignal nedstrøms for hver fluoroforet åben læse ramme for at sikre sammenlignelig og effektiv behandling af begge udskrifter for henholdsvis tdtomato og egfp. Sammenlignet med QRT-PCR baserede metoder5,12, denne FACS-baserede tilgang repræsenterer en lav pris og høj gennemløb kompatibelt alternativ, da ingen komplicerede ekstraktions protokoller for inficeret cellekultur og ingen dyre antistoffer mod immunfluorescens farvning er nødvendige. Da en defineret mængde fluorescerende celler analyseres via flowcytometri, er analysen af celle cyklus hæmmende midler også mulig på en kvantitativ måde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Polyomaviruser, ligesom BK-Polyomavirus (BKPyV), kan forårsage alvorlige patologier hos immunkompromitterede patienter. Men da der i øjeblikket ikke findes meget effektive antivirale lægemidler, er det nødvendigt at måle, hvilke virkninger potentielle antivirale agenser har. Her blev en dual fluorescens reporter, der tillader analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet, konstrueret til at kvantificere virkningen af potentielle antivirale lægemidler på viral genekspression via tdTomato og eGFP Udtryk. Hertil kommer, ved at klone bkpyv-nccr amplikoner, som i denne protokol er blevet eksemplarisk opnået fra det blod-afledte DNA af immunkompromitterede Nyretransplanterede patienter, virkningen af nccr-rearrangementerne på viral gen udtryk kan bestemmes. Efter kloning af de patient afledte amplicons blev HEK293T celler transficeret med reporter-plasmiderne og behandlet med potentielle antivirale midler. Efterfølgende blev cellerne underkastet FACS-analyse til måling af de gennemsnitlige fluorescens intensiteter 72 h post transfection. For også at teste analysen af lægemidler, der har en potentiel celle cyklus hæmmende virkning, kun transficeret og dermed fluorescerende celler anvendes. Da denne analyse udføres i store T-antigen, der udtrykker celler, kan virkningen af tidlig og sen ekspression analyseres på en gensidigt uafhængig måde.

I dette repræsentative eksperiment blev BK-Polyomavirus-den ikke-kodende kontrol region drevet transkriptional aktivitet målt via flowcytometri. Desuden blev en mTOR-hæmmer, som kan anvendes til behandling af patienter efter reaktivering af BKPyV, testet for sin hæmning af det virale tidlige genudtryk. Til dette formål blev der anvendt en dobbelt fluorescens-reporter-analyse som offentliggjort tidligere5. Det overordnede arbejdsgangs skema for den eksperimente...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Måling af BK-Polyomavirus ikke-kodende kontrol region drevet Transkriptional aktivitet via flowcytometri

I dette manuskript er en protokol præsenteret for at udføre FACS-baserede måling af BK-Polyomavirus transkriptional aktivitet ved hjælp af HEK293T celler transficeret med en tovejs reporter plasmid udtrykker tdtomato og egfp. Denne metode giver yderligere mulighed for at kvantitativt bestemme indflydelsen af nye forbindelser på viral transkriptionen.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Det overordnede formål med denne protokol er at måle BK-polyomavirus ikke-kodning kontrolområde drevet transskriptionel aktivitet ved at måle dobbelt fluorescerende celler via flow cytometri. BK-polyomavirus kan forårsage alvorlige patologier hos immunkompromitterede patienter, især hos patienter med nyretransplantation. Men da meget effektiv antivirus er i øjeblikket ikke tilgængelige, metoder, der måler den potentielle anti-virale virkning af andre forbindelser er påkrævet.Denne metode gør det muligt for virologer at analysere virkningen af potentielle anti-virale midler, der påvirker BK-polyomavirus transskriptionel aktivitet drevet af ikke-kodning kontrol region. Denne analyse gør det endvidere muligt at undersøge omlægningsarrangementenes indflydelse på initiativtageraktiviteten i forhold til arketypiske ikke-kodende kontrolregioner. Fordelen ved at studere den virale promotor aktivitet med en dobbelt fluorescens rapport er, at tidlig og sen genekspression kan analyseres i en gensidigt uafhængig måde.Desuden er den vanskelige perforering af viruslagre og langsigtede eksperimenter med smitsomme celler ikke nødvendige, da kun transficerede celler og lysstofrør analyseres, også lægemidler, der reducerer cellernes levedygtighed og perforering, kan undersøges. Denne protokol følger retningslinjerne for menneskelig forskning som godkendt af det etiske udvalg af det medicinske fakultet ved Universitetet i Duisburg-Essen. Det første skridt er at indsamle blodprøver til isolering af polyomavirus DNA.Indsamle mindst tre milliliter blod i EDTA erhvervelse rør. Centrifuge prøven ved 2, 500 G i 15 minutter og pipette plasmaet i et nyt rør. Forbered 40 mikroliter protein SK i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør, og der tilsættes 400 mikrolitersplasma ved pipettering.Isoler DNA'et ved hjælp af et DNA blot ekstraktionssæt som beskrevet i producentens anvisninger. Forbered master mix til pre-PCR ved hjælp af primer par A i et samlet volumen på 50 mikroliter og bruge den tidligere isolerede DNA. Fordel 45 mikroliter af master mix i PCR rør.Der tilsættes fem mikroliter af det isolerede DNA i PCR-rørene, og PCR køres med reaktionsbetingelserne som vist i tabel tre. Gentag denaturering glødning og udvidelse i 35 cyklusser. For indlejret program, skal du bruge primer par B, husly begrænsning steder for kloning.Bland 10 mikroliter af PCR-produktet med to mikroliter af seks gange gelbelastningsfarvestof. Der indlæses 10 mikroliter af blandingen på en 1,5% agarosegel, og gelen køres i 30 minutter ved 60 milliampere. Visualiser gelen ved hjælp af et passende UV-dokumentationssystem.Rens PCR-ampliconerne ved hjælp af et PCR-rensesæt i henhold til producentens anvisninger. Fordøje de rensede ampliconer med indikatoren begrænsning enzymer i to timer ved 37 grader Celsius. Gentag rensningstrinnene for at rense de fordøjede ampliconer.Parallelt hermed fordøje også plasmid rygraden. Analysér den fordøjede plasmid-rygrad på en 0,8% lav mount agarose gel. Gelen må ikke køres ved en højere strøm end 40 milliampere.Visualiser DNA-fragmenter ved hjælp af lang bølge UV-lys og skæres ud rygraden bøjet ved hjælp af en ren skalpel. Undgå lange UV-eksponeringstider for at forhindre DNA-skader. Hegn til det stykke flomel gel fragment i en ny 1,5 milliliter mikro-centrifuge rør.Varm rygraden indeholdende lav tilstand agarose stykke i 10 minutter ved 65 grader Celsius for at smelte gelen stykke og bland hvert andet minut ved blid vortexing. Den smeltede gel kan anvendes direkte til ligation. Ligate rygrad og fordøjet amplicon ved hjælp af T4 DNA ligase natten over ved 16 grader Celsius.Efter standard kloning procedure, isolere plasma DNA. Udfør begrænsning enzym fordøjelsen for at kontrollere for positive kloner og visualisere fordøjet fragmenter på en 1% agarose gel. Seed 100, 000 HEK293T celler pr brønd af de 12 godt plade 24 timer før transfektion og inkubere natten over ved 37 grader Celsius, opretholde aktiv spredning under transfektion.Cellerne skal være ca. 80% sammenløb ved transfektion. 250 mikroliter reducerede serummedier anbringes i sterilt rør, og der tilsættes et mikrogram af hver rapporteret plasma-DNA, og der blandes forsigtigt ved pipettering. Der tilsættes tre mikroliter af transfektionsreage til DNA-blandingen, og bland forsigtigt ved pipettering og inkubering i 15 minutter ved 22 grader Celsius.Tilsæt blandingen, drop-wise til brønden og forsigtigt distribuere til brønden. Efter fire timer udskiftes supernatanten med frisk medium, der indeholder testmidlerne og opløsningsmiddelkontrollen. I dette eksempel blev mTOR-hæmmerne INK-128 og rapamycin anvendt.Inkubere ved 37 grader Celsius indtil analyse. Kontroller celler for rød og grøn fluorescens under fluorescensmikroskopet. Rød og grøn fluorescens svarer til henholdsvis det tidlige og sene BK-polyomavirus-genekspression.72 timer efter transfektion, omhyggeligt stræber supernatant. Cellerne vaskes to gange med en milliliter kold PBS. Tilsæt forsigtigt 500 mikroliter trypsin og drej pladen en smule for at undgå for tidlig løsrivelse af cellerne.Dette trin er vigtigt for at undgå celle doublets. Efter tilføjelse, trypsin fjernes direkte med den samme pipette spids. Inkuber cellerne i mindst fem minutter ved 37 grader Celsius.Re-suspendere trypsin S celler med en milliliter PBS indeholder 3% FCS og overføre suspensionen i formærkede FACS rør. Dapi tilsættes ved en koncentration på et mikrogram pr. milliliter før FACS-analysen. Analysér cellerne ved hjælp af et flowcytometer.For hver prøve måles mindst 10.000 levende celler. Indledende kompensation er afgørende for at skelne mellem røde og grønne signaler for at opnå nøjagtige resultater. Den ikke-kodning kontrol regent blev forstærket ved hjælp af en indlejret PCR protokol ved hjælp af den indre primer par, som huser begrænsning steder for kloning.Amplicon verifikationen blev udført via agarose gel elektroforese Mens amplicons stammer fra arketypiske NCCR sekvenser på en homogen størrelse fordeling i gelen, dem, der stammer fra omarrangerede NCCRs med indsættelser og sletninger, afveg i deres størrelse. Udvælgelsen af positive kloner, der indeholder NCCR, blev verificeret ved begrænsningsanalyse. Det lille afstandsregionen blev erstattet af de større NCCR-fragmenter, der indikerede positive kloner.Plasmid DNA isoleret fra verificerede kloner blev sendt til pyrosequencing. I dette eksempel blev sletningen i P-blokken og erstatningen i O-blokken fundet. HEK293T-celler blev transfet med respekt for den rapporterelige konstruktion, og NCCR-aktiviteten blev overvåget af en fluorescensmikroskopi.Røde og grønne fluorescerende svarede til henholdsvis tidlig og sen BK-polyomavirus-genekspression. Den første NCCR viste et stærkt sent genudtryk, mens det andet eksempel havde et forholdsvis stærkt tidligt, men moderat sent genekspression. DAPI negative celler blev gated og en prik plot blev oprettet viser eGFP versus tdTomato.Prøver, der var negative såvel som positive for tdTomato eller eGFP kun blev inkluderet i analysen. Der blev afledt gennemsnitlige fluorescensintensiteter fra hver testklon. I dette eksempel reducerede behandlingen med den dobbelte mTOR-hæmmer INK128 signifikant tdTomato MFI, hvilket betyder, at tidlig ekspression blev hæmmet.Denne metode gør det muligt at identificere aktuelt anvendte og andre forbindelser til at opdage BK-polyomavirus gennem transskriptionel aktivitet. I begyndelsen af genekspression, dette decideret bestemmer den virale konsekvenser. Hæmmende dråber kan anses for at være anvendt som agenter for de immunkompromitterede patienter i tilfælde af genaktivering af BK-polyomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flowsortering og Exome-sekventering af Reed-Sternberg-cellerne af klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down Procedure til identifikation af en længe ikke-kodende RNA RNA mål

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celle baseret Assays af SINEUP ikke-kodende RNA'er, der specifikt kan forbedre mRNA Oversættelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Ved hjælp af Sniper-Cas9 til at minimere Off target effekter af CRISPR-Cas9 uden tab af målaktiviteten Via styret Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvleder sekvensering for præimplantations genetisk testning for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstige RNA polymerase II forlængede komplekser til dissekering af co-transkriptionelle RNA-behandlings hændelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...