Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

De auteurs bedanken Barbara Bleekmann voor de uitstekende technische assistentie. Deze studies werden ondersteund door het IFORES-programma van de Universiteit van Duisburg-Essen Medical School en het RIMUR-programma van de University Alliance Ruhr en Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). De auteurs danken de Jürgen-manchot-Stiftung voor het doctoraats Genootschap van Helene Sertznig en voortdurende steun. Het verzamelen en gebruiken van patiëntenmateriaal is goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Dit protocol volgt de richtlijnen van menselijk onderzoek zoals goedgekeurd door de ethiek Committee van de medische faculteit van de Universiteit van Duisburg-Essen (14-6028-Bo).
1. verzameling van bloed-of urine monsters en isolatie van polyomavirussen-DNA
<ol><li>Verzamel ten minste 3 mL bloed in EDTA-buisjes of urine in acquisitie buisjes.</li>
	<li>Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 2.500 x g . Indien nodig, Pipetteer plasma in een nieuwe buis en bewaar de plasma...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

In dit artikel wordt een veelgebruikte methode gepresenteerd die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late Promoter activiteit mogelijk maakt. De NCCR-activiteit kan gelijktijdig worden gemeten en heeft geen lysis nodig van de getransfunteerde cellen. Bovendien kan een relatief groot aantal cellen worden geanalyseerd en is de co-transfectie van extra markers voor normalisatie van de fluorescentie waarden niet nodig.
Een essentieel onderdeel van deze metho...

Polyomavirussen vertegenwoordigen een onafhankelijke familie van kleine dubbel-gestrande DNA (dsDNA) virussen met het Simian virus 40 (SV40) als prototype soort. De primaire infectie treedt voornamelijk op tijdens de kindertijd, die meestal doorgaat zonder ziektesymptomen en meestal latente infecties veroorzaken in immuun competente hosts. Het BK-polyomavirus (BKPyV) blijft voornamelijk bestaan in nierbuisjes cellen zonder nefropathologieën, echter, in geval van aantasting van de immuun-competentie na niertransplantatie het virus kan reactiveren en veroorzaken ernstige schade en verminderde transplantaat functie bij het bereiken van een hoge hersenen (1 x 104 bkpyv DNA-kopieën/ml)1,2. Bij ongeveer 10% van de niertransplantatie ontvangers resulteert reactivering van het BK-polyomavirussen (bkpyv) in een met polyomavirussen geassocieerde nefropathie (pyvan), die tot 80% geassocieerd met een hoog risico op renale allotransplantaat storingen3,4 . Aangezien er geen goedgekeurde antivirale middelen beschikbaar zijn, is de huidige therapie gebaseerd op de reductie van immunosuppressie. Interessant, mTOR-remmers lijken te hebben een antivirale effect; Zo kan het overschakelen van de immunosuppressieve therapie op mtor-gebaseerde immunosuppressie een alternatieve benadering zijn om progressie van de bkpyv hersenen5,6,7te voorkomen. Echter, het mTOR gebaseerde antivirale mechanisme is momenteel nog niet volledig begrepen. Daarom zijn methoden vereist voor het meten van de impact van potentiële antivirale middelen in klinisch relevante concentraties.
Het circulaire genoom van de BKPyV bestaat uit ongeveer 5 KB die een niet-coderende controle regio (NCCR) verveelt die dient als een bron van replicatie en tegelijkertijd een bidirectionele promotor die de uitdrukking van vroege en late fase mRNA transcripten besturen. Aangezien spontaan voorkomende nccr-herschikkingen, verwijderingen en duplicaties worden aangetroffen in pathogene bkpyv8 en aanzienlijk worden opgehoopt bij patiënten die lijden aan pvan5,9, een vergelijking van archetypische (WT) en Re-gerangschikte (RR) NCCR-activiteiten zijn nuttig om virale replicatieve fitness te karakteriseren.
Zoals samengevat in Figuur 1, beschrijft dit protocol een veelgebruikte methode om de BKPyV nccr-transcriptionele activiteit te meten door de fluorescentie van twee fluoroforen tdTomato en EGFP te kwantificeren, uitgedrukt door een reporter plasmide5, 9,10,11. De procedure wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van het SV40 grote T-antigeen (lTAg), die het mogelijk maakt om de impact van potentiële antivirale middelen op de vroege en late NCCR-activiteit afzonderlijk te analyseren5. Deze assay analyseert verder de impact van herschikkingen op de nccr-activiteit en vergelijking met WT-nccrs5,9. De reporter plasmide herbergt het SV40 late polyadenylatie signaal stroomafwaarts van elk de open reading frame om te zorgen voor een vergelijkbare en efficiënte verwerking van beide transcripten voor respectievelijk tdtomato en EGFP. Vergeleken met QRT-PCR-gebaseerde methoden5,12, vertegenwoordigt deze op FACS gebaseerde aanpak een laaggeprijsde en hoge doorvoer compatibel alternatief omdat geen ingewikkelde extractie protocollen voor geïnfecteerde celcultuur en geen dure Er zijn antilichamen voor immuun fluorescentie kleuring nodig. Bovendien, aangezien een bepaalde hoeveelheid fluorescerende cellen wordt geanalyseerd via Flowcytometrie, is de analyse van celcyclus remmende middelen ook mogelijk op een kwantitatieve manier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Polyomavirussen, zoals het BK-polyomavirus (BKPyV), kunnen ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. Echter, aangezien zeer effectieve antivirale middelen momenteel niet beschikbaar zijn, zijn methoden voor het meten van de impact van potentiële antivirale agenten vereist. Hier werd een dubbele fluorescentie reporter die de analyse van de BKPyV non-coding Control-Region (NCCR) gedreven vroege en late promotor activiteit mogelijk gemaakt om de impact van potentiële antivirale geneesmiddelen op virale genexpressie via tdTomato en eGFP te kwantificeren. Expressie. Bovendien kan door het klonen van BKPyV-NCCR-amplicons die in dit protocol voorbeeld zijn verkregen uit het bloed afgeleide DNA van immuungecompromitteerde niertransplantatiepatiënten, de impact van NCCR-rearrangementen op virale genexpressie worden bepaald. Na het klonen van de patiënt afgeleide amplicons, HEK293T cellen werden met de reporter-plasmiden, en behandeld met potentiële antivirale middelen. Vervolgens werden de cellen onderworpen aan FACS-analyse voor het meten van de gemiddelde fluorescentie intensiteiten 72 h post transfectie. Om ook de analyse van geneesmiddelen die een potentiële celcyclus remming van effect te testen, alleen getransffecteerd en dus fluorescerende cellen worden gebruikt. Aangezien deze test wordt uitgevoerd in een groot T-antigeen dat cellen uitdrukt, kan de impact van vroegtijdige en late expressie op een wederzijds onafhankelijke manier worden geanalyseerd.

In dit representatieve experiment werd de door de BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gestuurde transcriptionele activiteit gemeten via Flowcytometrie. Bovendien werd een mTOR-remmer, die zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling van patiënten na BKPyV reactivatie, getest op de remming van de virale vroege genexpressie. Hiertoe werd een dubbele fluorescentie-reporter test gebruikt zoals eerder gepubliceerd5. Het algemene workflowschema van de experi...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie

In dit manuscript wordt een protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van FACS-based meting van de transcriptionele activiteit van BK-polyomavirus door gebruik te maken van HEK293T cellen met een bidirectionele reporter plasmide die tdTomato en eGFP uitdrukt. Deze methode maakt het mogelijk om de invloed van nieuwe verbindingen op virale transcriptie kwantitatief te bepalen.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Het algemene doel van dit protocol is om BK-polyomavirus niet-codering controle regio gedreven transcriptie activiteit te meten door het meten van dubbele fluorescerende cellen via flow cytometrie. Het BK-polyomavirus kan ernstige pathologieën veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten, vooral bij niertransplantatieontvangers. Echter, aangezien zeer effectieve antivirus zijn momenteel niet beschikbaar, methoden meten van de potentiële anti-virale impact van andere verbindingen zijn vereist.Deze methode stelt virologen in staat om de impact van potentiële antivirale middelen die de BK-polyomavirus transcriptie activiteit gedreven door de niet-codering controle regio te analyseren. Deze test maakt het verder mogelijk om de invloed van herschikkingen op de promotoractiviteit te bestuderen in vergelijking met archetypische niet-coderingsgebieden. Het voordeel van het bestuderen van de virale promotor activiteit met een dubbele fluorescentie rapport is dat vroege en late genexpressie kan worden geanalyseerd in een wederzijds onafhankelijke manier.Bovendien zijn de moeilijke perforatie van virusvoorraden en langdurige infectieuze celkweekexperimenten niet nodig omdat alleen doorgestemde en fluorescerende cellen worden geanalyseerd, ook geneesmiddelen die de levensvatbaarheid van cellen en perforatie verminderen, kunnen worden bestudeerd. Dit protocol volgt de richtlijnen van menselijk onderzoek zoals goedgekeurd door de ethische commissie van de medische faculteit van de Universiteit van Duisburg-Essen. De eerste stap is het verzamelen van bloedmonsters voor de isolatie van polyomavirus DNA.Verzamel ten minste drie milliliter bloed in EDTA acquisitie buizen. Centrifugeren het monster op 2, 500 G gedurende 15 minuten en pipette het plasma in een nieuwe buis. Bereid 40 microliter eiwit SK in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis en voeg 400 microliters plasma door pipetting.Isoleer het DNA met behulp van een DNA-vlek extractie kit zoals beschreven in de instructies van de fabrikant. Bereid de mastermix voor de pre-PCR met primerpaar A in een totaal volume van 50 microliters en gebruik het eerder geïsoleerde DNA. Verdeel 45 microliter van de master mix in de PCR buizen.Voeg vijf microliter van het geïsoleerde DNA toe aan de PCR-buizen en voer de PCR uit met de reactieomstandigheden zoals afgebeeld in tabel drie. Herhaal denaturatie annealing en uitbreiding in 35 cycli. Voor geneste toepassing, gebruik primer paar B, herbergen van de beperking sites voor klonen.Meng 10 microliter van het PCR-product met twee microliters van zesvoudige gel ladingkleurstof. Laad 10 microliter van de mix op een 1,5% agarose gel en voer de gel gedurende 30 minuten uit op 60 milliampère. Visualiseer de gel met behulp van een geschikt UV-documentatiesysteem.Zuiver de PCR amplicons met behulp van een PCR zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Verteren de gezuiverde amplicons met de indicator beperking enzymen gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Herhaal de zuiveringsstappen om de verteerde amplicons te zuiveren.Tegelijkertijd ook verteren de plasmide ruggengraat. Analyseer de verteerde plasmid ruggengraat op een 0,8% lage mount agarose gel. Laat de gel niet op een hogere stroom dan 40 milliampère.Visualiseer DNA-fragmenten met behulp van lange golf UV-licht en knip de ruggengraat gebogen met behulp van een schone scalpel. Vermijd lange UV-blootstellingstijden om DNA-schade te voorkomen. Hek voor het stuk flomel gel fragment in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Verwarm de ruggengraat met lage modus agarose stuk gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius om de gel stuk smelten en meng elke twee minuten door zachte vortexing. De gesmolten gel kan direct worden gebruikt voor ligatie. Ligate ruggengraat en de verteerde amplicon met behulp van T4 DNA ligase 's nachts op 16 graden Celsius.Na de standaard kloonprocedure isoleert u het plasma-DNA. Voer beperking enzym spijsvertering uit om te controleren op positieve klonen en geviseerde fragmenten te visualiseren op een 1%agarose gel. Zaad 100, 000 HEK293T cellen per put van de 12 put plaat 24 uur voor de transfectie en incubaat 's nachts bij 37 graden Celsius, handhaven actieve proliferatie tijdens transfectie.Cellen moeten ongeveer bij 80% samenvloeiing bij transfectie zijn. Plaats 250 microliter met verlaagde serummedia in steriele buis en voeg één microgram van elk gerapporteerd plasma-DNA toe en meng zachtjes door pipetting. Voeg drie microliters van het transfectiereagens toe aan het DNA-mengsel en meng voorzichtig door 15 minuten te pipetten en uit te broeden bij 22 graden Celsius.Voeg het mengsel, drop-wise aan de put en voorzichtig verdelen om de put. Vervang na vier uur de supernatant door vers medium met de testmiddelen en oplosmiddelcontrole. In dit voorbeeld werden de mTOR-remmers INK-128 en rapamycine gebruikt.Incubeer bij 37 graden Celsius tot analyse. Controleer cellen op rode en groene fluorescentie onder de fluorescentiemicroscoop. Rode en groene fluorescentie komen overeen met respectievelijk de vroege en late BK-polyomavirus genexpressie.72 uur na de transfectie, zorgvuldig streven naar de supernatant. Was de cellen twee maal met een milliliter koude PBS. Voeg voorzichtig 500 microliter trypsine toe en draai de plaat iets om voortijdige loslating van de cellen te voorkomen.Deze stap is belangrijk om cel doubletten te voorkomen. Daarna wordt trypsine direct verwijderd met dezelfde pipetpunt. Broed de cellen minstens vijf minuten bij 37 graden Celsius.Schors trypsin S-cellen opnieuw met één milliliter PBS met 3%FCS en breng de ophanging over in vooraf gelabelde FACS-buizen. Voeg DAPI toe met een concentratie van één microgram per milliliter voorafgaand aan facs-analyse. Analyseer de cellen met behulp van een stroomcytometer.Meet voor elk monster ten minste 10.000 levende cellen. Initiële compensatie is essentieel om rode en groene signalen te onderscheiden om nauwkeurige resultaten te bereiken. De niet-coderingscontroleregenter werd versterkt gebruikend een geneste PROTOCOL PCR gebruikend het binnenste primerpaar dat de beperkingsplaatsen voor het klonen koestert.De ampliconverificatie werd uitgevoerd via agarose gel elektroforese Terwijl de amplicons afgeleid van archetypische NCCR sequenties op een homogene grootteverdeling in de gel, die afkomstig zijn van herschikte NCV's met invoegingen en schrappingen, verschilden in hun grootte. De selectie van positieve klonen die de NCCR bevatten, werd geverifieerd door middel van een beperkingsanalyse. Het kleine spacer gebied werd vervangen door de grotere NCCR fragmenten die wijzen op positieve klonen.Plasmide DNA geïsoleerd van geverifieerde klonen werden verzonden voor pyrosequencing. In dit voorbeeld zijn de verwijdering in het P-blok en de vervanging in O-blok gedetecteerd. HEK293T cellen werden van voorbijgaande aard vervangen met het respect voor te rapporteren constructie en NCCR activiteit werd gecontroleerd door een fluorescentie microscopie.Rode en groene fluorescerende fluorescerende respectievelijk vroege en late BK-polyomavirus genexpressie. De eerste NCCR toonde een sterke late genexpressie, terwijl het tweede voorbeeld een relatief sterke vroege maar matige late genexpressie had. DAPI negatieve cellen werden gated en een stip plot werd gemaakt met eGFP versus tdTomato.Zowel negatieve als positieve voor tdTomato of eGFP werden in de analyse opgenomen. Gemiddelde fluorescentie intensiteiten werden afgeleid van elke test kloon. In dit voorbeeld verminderde de behandeling met de dubbele mTOR-remmer INK128 de tdTomato MFI aanzienlijk, wat betekent dat vroege expressie werd geremd.Deze methode maakt het mogelijk om momenteel gebruikte en andere verbindingen te identificeren om het BK-polyomavirus te detecteren door middel van transcriptieactiviteit. In de vroege genexpressie bepaalt dit beslist de virale implicatie. Remmende druppels kunnen worden beschouwd als middelen voor de immuungecompromitteerde patiënten in het geval van de REACT-polyomavirus reactivering.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cel gebaseerde analyses van SINEUP niet-coderende RNAs die specifiek mRNA vertaling kunnen verbeteren

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluatie van een universele geneste omgekeerde transcriptie polymerase chain reactie voor de opsporing van Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstmatige RNA polymerase II-rek complexen voor het ontleden van co-transcriptionele RNA-verwerkings gebeurtenissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...