Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Les auteurs remercient Barbara Bleekmann pour son excellente assistance technique. Ces études ont été soutenues par le programme IFORES de l'École de médecine de l'Université de Duisburg-Essen et le programme RIMUR de l'Alliance universitaire Ruhr et le Centre de recherche Mercator Ruhr (MERCUR). Les auteurs remercient le Juergen-Manchot-Stiftung pour la bourse de doctorat d'Hélène Sertznig et son soutien constant. La collecte et l'utilisation du matériel patient ont été approuvées par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'Université du Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l'Université de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Collecte d'échantillons de sang ou d'urine et isolement de l'ADN du polyomavirus
<ol><li>Recueillir au moins 3 ml de sang dans les tubes EDTA ou l'urine dans les tubes d'acquisition.</li>
	<li>Centrifuger l'échantillon à 2 500 x g pendant 15 min. Au besoin, pipette plasma dans un nouveau tube et stocke...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

Dans cet article, une méthode couramment utilisée est présentée qui permet l'analyse de la BKPyV non-codage de contrôle-région (NCCR) conduit début et tard l'activité du promoteur. L'activité du NCCR peut être mesurée simultanément et n'a pas besoin de lyse des cellules transfectées. En outre, un nombre relativement important de cellules peut être analysée et la co-transfection de marqueurs supplémentaires pour la normalisation des valeurs de fluorescence n'est pas nécessaire.
<p class="jove_content"...

Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l'ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L'infection primaire se produit principalement pendant l'enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l'atteinte d'une virémie élevée (1 x 104 copies d'ADN BKPyV/mL)1,2. Chez environ 10 % des receveurs de greffe sinain, la réactivation du BK-polyomavirus (BKPyV) entraîne une néphropathie associée au polyomavirus (PyVAN), qui était jusqu'à 80 % associée à un risque élevé d'échecs d'allogreffe rénale3,4 . Comme aucun antiviral approuvé n'est disponible, le traitement actuel est basé sur la réduction de l'immunosuppression. Fait intéressant, les inhibiteurs de mTOR semblent avoir un effet antiviral ; ainsi, le passage de la thérapie immunosuppressive à l'immunosuppression mTOR-basée pourrait représenter une approche alternative pour empêcher la progression de la virémie de BKPyV5,6,7. Cependant, le mécanisme antiviral à base de mTOR est actuellement encore incomplet. Ainsi, des méthodes mesurant l'impact d'agents antiviraux potentiels dans des concentrations cliniquement pertinentes sont nécessaires.
Le génome circulaire du BKPyV se compose d'environ 5 kb abritant une région de contrôle non codante (NCCR) qui sert d'origine de la réplication et, en même temps, un promoteur bidirectionnel conduisant à l'expression des transcriptions de l'ARNm de phase précoce et tardive. Puisque les réarrangements, les suppressions et les duplications spontanément se produisant NCCR se trouvent dans LE BKPyV8 pathogène et significativement accumulés dans les patients souffrant de PVAN5,9, une comparaison de l'archétype (wt) et les activités du NCCR réarrangées (rr) sont utiles pour caractériser la condition physique répliquif virale.
Comme résumé à la figure 1, ce protocole décrit une méthode couramment utilisée pour mesurer l'activité transcriptionnelle DU RNC DE BKPyV en quantifiant la fluorescence de deux fluorophores tdTomato et eGFP exprimées à partir d'un plasmide de journaliste5, 9,10,11. La procédure est effectuée en présence de l'antigène T sV40 grand (lTAg), qui permet d'analyser l'impact des agents antiviraux potentiels sur le début et la fin NCCR-activité séparément5. Cet analyse analyse davantage l'impact des réarrangements sur l'activité du NCCR et la comparaison avec les Wt-NCCRs5,9. Le plasmide de journaliste héberge le signal de polyadenylation en retard de SV40 en aval de chaque cadre de lecture ouvert de fluorophore pour assurer le traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato et eGFP, respectivement. Comparé e aux méthodes qRT-PCR5,12, cette approche basée sur le FACS représente une alternative compatible à faible coût et à haut débit puisqu'aucun protocole d'extraction compliqué pour la culture cellulaire infectée et aucun coût des anticorps pour la coloration de fluorescence immunisée sont nécessaires. En outre, puisqu'une quantité définie de cellules fluorescentes sont analysées par cytométrie de flux, l'analyse des agents inhibiteurs du cycle cellulaire est également possible d'une manière quantitative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Les polyomavirus, comme le BK-polyomavirus (BKPyV), peuvent causer des pathologies graves chez les patients immunodéprimés. Cependant, comme les antiviraux très efficaces ne sont pas disponibles à l'heure actuelle, des méthodes mesurant l'impact des agents antiviraux potentiels sont nécessaires. Ici, un journaliste à double fluorescence qui permet l'analyse de la région témoin non codante BKPyV (NCCR) conduite tôt et tardivement par l'activité de promoteur a été construit pour quantifier l'impact des médicaments antiviraux potentiels sur l'expression des gènes viraux par l'intermédiaire de tdTomato et eGFP expression. En outre, en clonant des amplicons de BKPyV-NCCR qui dans ce protocole ont été exemplarily obtenus à partir de l'ADN blood-dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis, l'impact des NCCR-réarrangements sur l'expression virale de gène peut être déterminé. Après clonage des amplicons dérivés de patient, les cellules de HEK293T ont été transfected avec les reporter-plasmides, et traitées avec des agents antiviraux potentiels. Par la suite, des cellules ont été soumises à l'analyse FACS pour mesurer les intensités moyennes de fluorescence 72 h après la transfection. Pour tester également l'analyse des médicaments qui ont un effet inhibiteur du cycle cellulaire potentiel, seules les cellules transfectées et donc fluorescentes sont utilisées. Puisque cet analyse est effectué dans de grandes cellules exprimant estomnons de T Antigène, l'impact de l'expression tôt et tard peut être analysé d'une manière mutuellement indépendante.

Dans cette expérience représentative, l'activité transcriptionnelle pilotée par la région de contrôle non codant de BK-polyomavirus a été mesurée par cytométrie de flux. En outre, un inhibiteur de mTOR, qui pourrait être employé pour traiter des patients après la réactivation de BKPyV, a été examiné pour son inhibition de l'expression tôt virale de gène. À cette fin, un double dis-t-il de fluorescence-reporter a été employé comme édité précédemment<sup class="xr...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Mesure de bk-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Dans ce manuscrit, un protocole est présenté pour effectuer la mesure FACS-basée de bk-polyomavirus activité transcriptionnelle en utilisant des cellules HEK293T transfecté avec un plasmide journaliste bidirectionnel exprimant tdTomato et eGFP. Cette méthode permet en outre de déterminer quantitativement l'influence de nouveaux composés sur la transcription virale.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

L’objectif global de ce protocole est de mesurer l’activité transcriptionnelle de la région de contrôle non codant du BK-polyomavirus en mesurant les cellules fluorescentes doubles par cytométrie de flux. Le BK-polyomavirus peut causer des pathologies graves chez les patients immunocompromisés, en particulier chez les receveurs de greffe rénale. Cependant, étant donné que les antivirus très efficaces ne sont actuellement pas disponibles, des méthodes mesurant l’impact antiviraux potentiel d’autres composés sont nécessaires.Cette méthode permet aux virologues d’analyser l’impact des agents antiviraux potentiels affectant l’activité transcriptionnelle du BK-polyomavirus entraînée par la région de contrôle non codant. Cet essai permet en outre d’étudier l’influence des réarrangements sur l’activité du promoteur par rapport aux régions de contrôle non codantes archétypiques. L’avantage d’étudier l’activité virale de promoteur avec un rapport de fluorescence double est que l’expression tôt et tardive de gène peut être analysée d’une manière mutuellement indépendante.En outre, la perforation difficile des stocks de virus et les expériences de culture cellulaire infectieuse à long terme ne sont pas nécessaires puisque seules les cellules transfected et fluorescentes sont analysées, également des médicaments réduisant la viabilité cellulaire et la perforation peuvent être étudiés. Ce protocole suit les lignes directrices de la recherche humaine approuvées par le comité éthique de la faculté de médecine de l’Université de Duisburg-Essen. La première étape consiste à prélever des échantillons de sang pour l’isolement de l’ADN du polyomavirus.Recueillir au moins trois millilitres de sang dans des tubes d’acquisition EDTA. Centrifuger l’échantillon à 2500 G pendant 15 minutes et pipette le plasma dans un nouveau tube. Préparer 40 microlitres de protéines SK dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter 400 microlitres de plasma par pipetting.Isoler l’ADN à l’aide d’une trousse d’extraction de taches d’ADN décrite dans les instructions du fabricant. Préparez le mélange principal pour le pré-PCR à l’aide de la paire d’amorce A dans un volume total de 50 microlitres et utilisez l’ADN précédemment isolé. Distribuer 45 microlitres du mélange principal dans les tubes PCR.Ajouter cinq microlitres de l’ADN isolé dans les tubes PCR et exécuter le PCR avec les conditions de réaction comme illustré dans le tableau trois. Répétez l’annealage et l’extension de dénaturation en 35 cycles. Pour l’application imbriquée, utilisez la paire d’amorce B, hébergeant les sites de restriction pour le clonage.Mélangez 10 microlitres du produit PCR avec deux microlitres de teinture de chargement de gel six fois. Chargez 10 microlitres du mélange sur un gel agarose de 1,5 % et exécutez le gel pendant 30 minutes à 60 milliampères. Visualisez le gel à l’aide d’un système de documentation UV approprié.Purifiez les amplicons PCR à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Digérer les amplicons purifiés avec les enzymes de restriction indicateur pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Répétez les étapes de purification pour purifier les amplicons digérés.En parallèle, digérer également l’épine dorsale plasmide. Analyser l’épine dorsale plasmide digérée sur un gel d’agarose à faible teneur en monture de 0,8 %. Ne pas faire fonctionner le gel à un courant plus élevé que 40 milliampères.Visualisez les fragments d’ADN à l’aide de la lumière UV à ondes longues et découpez l’épine dorsale pliée à l’aide d’un scalpel propre. Évitez les longs temps d’exposition aux UV pour prévenir les dommages causés par l’ADN. Clôture pour le morceau de fragment de gel flomel dans un nouveau tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre.Chauffer l’épine dorsale contenant un morceau d’agarose à faible mode pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius afin de faire fondre le morceau de gel et mélanger toutes les deux minutes par vortex doux. Le gel fondu peut être directement utilisé pour la ligature. Ligate épine dorsale et l’amplicon digéré en utilisant ligase D’ADN T4 nuit à 16 degrés Celsius.Après la procédure standard de clonage, isoler l’ADN plasmatique. Effectuer la digestion des enzymes de restriction pour vérifier les clones positifs et visualiser les fragments digérés sur un gel de 1% agarose. Graine 100 000 cellules HEK293T par puits de la plaque de puits 24 heures avant la transfection et l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius, maintenir la prolifération active pendant la transfection.Les cellules doivent être approximativement à 80% confluency à la transfection. Placer 250 microlitres de sérum réduit dans le tube stérile et ajouter un microgramme de chaque ADN plasmatique rapporté et mélanger délicatement par pipetting. Ajouter trois microlitres du réaccente de transfection au mélange d’ADN et mélanger délicatement par pipetting et incuber pendant 15 minutes à 22 degrés Celsius.Ajouter le mélange, laisser tomber au puits et distribuer délicatement au puits. Après quatre heures, remplacer le supernatant par un milieu frais contenant les agents d’essai et le contrôle des solvants. Dans cet exemple, les inhibiteurs du mTOR INK-128 et de la rapamycine ont été utilisés.Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Vérifiez la fluorescence rouge et verte des cellules au microscope à fluorescence. La fluorescence rouge et verte correspond à l’expression précoce et tardive du gène BK-polyomavirus respectivement.72 heures après la transfection, aspirez soigneusement au surnatant. Lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS froid. Ajouter délicatement 500 microlitres trypsine et tourner légèrement la plaque pour éviter le décollement prématuré des cellules.Cette étape est importante pour éviter les doublets cellulaires. Après addition, la trypsine est enlevée directement avec la même pointe de pipette. Incuber les cellules pendant au moins cinq minutes à 37 degrés Celsius.Suspendre à nouveau les cellules trypsine S avec un millilitre de PBS contenant 3 % de FCS et transférer la suspension dans des tubes FACS pré-étiquetés. Ajouter dapi à une concentration d’un microgramme par millilitre avant l’analyse FACS. Analyser les cellules à l’aide d’un cytomètre d’écoulement.Pour chaque échantillon, mesurez au moins 10 000 cellules vivantes. La compensation initiale est essentielle pour distinguer les signaux rouges et verts pour obtenir des résultats précis. Le régent de contrôle non codant a été amplifié à l’aide d’un protocole PCR imbriqué à l’aide de la paire d’amorce intérieure qui abrite les sites de restriction pour le clonage.La vérification amplicon a été effectuée par électrophoresis de gel d’agarose tandis que les amplicons dérivés des séquences archétypiques de NCCR à une distribution homogène de taille dans le gel, ceux dérivés des RCNC réarrangés avec des insertions et des suppressions, différaient dans leur taille. La sélection de clones positifs contenant le NCCR a été vérifiée par analyse de restriction. La petite région de l’espaceur a été remplacée par les plus gros fragments du NCCR indiquant des clones positifs.L’ADN plasmide isolé des clones vérifiés a été envoyé pour le pyrosequencing. Dans cet exemple, la suppression dans le bloc P et la substitution dans le bloc O ont été détectées. Les cellules HEK293T ont été transitoirement transfectées dans le respect de la construction à déclarer et l’activité de NCCR a été surveillée par une microscopie de fluorescence.Les fluorescents rouges et verts correspondaient respectivement à l’expression précoce et tardive du gène BK-polyomavirus. Le premier NCCR a montré une forte expression tardive de gène tandis que le deuxième exemple a eu une expression tôt mais modérée de gène tôt comparativement forte. Les cellules négatives de DAPI ont été gated et une parcelle de point a été créée montrant eGFP contre tdTomato.Les échantillons qui étaient négatifs ainsi que ceux positifs pour tdTomato ou eGFP seulement ont été inclus dans l’analyse. Des intensités de fluorescence moyenne ont été dérivées de chaque clone d’essai. Dans cet exemple, le traitement avec l’inhibiteur double de mTOR INK128 a sensiblement réduit tdTomato MFI qui signifie que l’expression tôt a été inhibée.Cette méthode permet d’identifier les composés actuellement utilisés et d’autres pour détecter le BK-polyomavirus par l’activité transcriptionnelle. Dans l’expression précoce des gènes, cela détermine décidément l’implication virale. Des gouttes inhibitrices pourraient être considérées comme agents pour les patients immunocompromised dans le cas de la réactivation de BK-polyomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Le tri de flux et le séquençage Exome des cellules de Reed-Sternberg du lymphome de Hodgkin classique

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Recherche

Génétique

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA liste déroulante procédure pour identifier les cibles ARN d’un ARN Long Non codantes

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Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

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À l’aide de Sniper-Cas9 pour minimiser les effets hors cible de CRISPR-Cas9 sans la perte d’activité sur la cible Via évolution dirigée

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