Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

המחברים מודים לברברה בלקמן על סיוע טכני מעולה. מחקרים אלה תמכו על ידי IFORES-תוכנית של אוניברסיטת Duisburg-אסן הספר לרפואה ואת RIMUR-תוכנית של הברית האוניברסיטה הרוהר ומרקטור מרכז מחקר רוהר (MERCUR). המחברים מודים לג-מנצ-סטיפטונג עבור מלגת הדוקטורט של הלן סרצניג ותמיכה מתמדת. האיסוף והשימוש בחומר המטופל אושר על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של האוניברסיטה Duisburg-אסן (14-6028-BO).

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המחקר האנושי כפי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Duisburg-אסן (14-6028-BO).
1. אוסף דגימות דם או שתן ובידוד של דנ א וירוס רב-הסוכר
<ol><li>לאסוף לפחות 3 מ ל של דם בצינורות EDTA או שתן בצינורות הרכישה.</li>
	<li>צנטריפוגה את המדגם ב 2,500 x g</...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

במאמר זה, שיטה בשימוש נפוץ מוצגת המאפשרת ניתוח של BKPyV לא קידוד בקרת אזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות המקדם. ניתן למדוד את פעילות NCCR בו ואינה זקוקה לפירוק של התאים הניתנים להעברה. יתרה מזאת, ניתן לנתח מספר גדול יחסית של תאים ושיתוף ההעברה של סמנים נוספים לנורמליזציה של ערכי הקרינה הפלואור...

וירוסים פולידונים מייצגים משפחה עצמאית של קטן כפול תקועים DNA (dsDNA) וירוסים עם וירוס Simian 40 (SV40) כמו מינים אב טיפוס. הזיהום העיקרי מתרחשת בעיקר במהלך הילדות, אשר בדרך כלל להמשיך ללא תסמיני המחלה ובדרך כלל לגרום לזיהומים סמויים מארחים המוסמכים החיסונית. וירוס BK-פולידונים (BKPyV) ממשיך בעיקר בתאי tubules כליות מבלי לגרום לנפרולוגיה, עם זאת, במקרה של פגיעה ביכולת החיסון לאחר השתלת כליות הווירוס יכול להפעיל מחדש ולגרום נזקים חמורים השתל לקוי פונקציה בעת הגעה viremia גבוה (1 x 104 bkpyv העתקים DNA/mL)1,2. בתוך כ 10% של מקבלי השתלת כליה, ההפעלה מקדימה של וירוס BK-polyדונים (bkpyv) תוצאות וירוס מקושר הקשורים לנפרופתיה (pyvan), אשר היה עד 80% הקשורים בסיכון גבוה של כשלים השתלת כליות3,4 . מכיוון שלא קיימים סוכני אנטי-ויראליים מאושרים, הטיפול הנוכחי מבוסס על צמצום הדיכוי החיסוני. מעניין, מעכבי mTOR נראה שיש לו אפקט אנטי ויראלי; לפיכך, העברת הטיפול המדכא לדיכוי חיסוני מבוסס mtor עשוי לייצג גישה חלופית כדי למנוע התקדמות של virepyv ויסמיה5,6,7. עם זאת, מנגנון האנטי-ויראלי המבוסס על mTOR עדיין מובן לחלוטין. לפיכך, נדרשות שיטות למדידת ההשפעה של גורמי אנטי-ויראליים פוטנציאליים בריכוזים רלוונטיים של קליניות.
הגנום המעגלי של BKPyV מורכב כ 5 kb מחסה אזור שליטה ללא קידוד (NCCR) המשמש כמקור של השכפול ובמקביל יזם דו-כיווני המניע את הביטוי של מוקדם ומאוחר התעתיקים mRNA. מאז התרחשות באופן ספונטני nccr-rearrangements, מחיקות, וכפילויות מצויים ב-bkpyv הפתוגני8 והצטבר משמעותית בחולים הסובלים pvan5,9, השוואה של הארכיאופייני (wt) ו מסודרים מחדש (rr) NCCR-פעילויות מועילים לאפיין כושר replicative ויראלי.
כפי שסוכם באיור 1, פרוטוקול זה מתאר שיטה בשימוש נפוץ כדי למדוד את הפעילות הנפוצה של BKPyV nccr על ידי כימות הזריחה של שני fluorophores tdTomato ו-egfp ביטא מתוך הכתב פלבאמצע5, 9,10,11. ההליך מבוצע בנוכחות של האנטיגן T SV40 גדול (lTAg), אשר מאפשר לנתח את ההשפעה של סוכני אנטי ויראליים פוטנציאליים על מוקדם ומאוחר NCCR-פעילות בנפרד5. שיטת הפעולה עוד מנתחת את ההשפעה של הסדרים מחדש על פעילות nccr והשוואה עם wt-NCCRs5,9. הכתב פלסמאמצע הנמלים את האות SV40 מאוחר במורד במורד של כל fluorophore לפתוח מסגרת קריאה כדי להבטיח עיבוד דומה ויעיל של שני התעתיקים של tdTomato ו-eGFP, בהתאמה. בהשוואה לשיטות המבוססות על רביעיית ה-PCR,5,12, גישה זו מבוססת-facs מייצגת עלות נמוכה וחלופה גבוהה לתפוקה בקצב גבוה, מאחר שאין פרוטוקולי הוצאה מסובכים לתרבות התא הנגועה וללא יקר יש צורך בנוגדנים לצביעת מערכת הקרינה החיסונית. יתר על כן, מאז כמות מוגדרת של תאי פלורסנט מנותח באמצעות cy, הניתוח של מחזור התאים הסוכנים מעכבים ניתן גם באופן כמותי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

וירוסים מפולדונים, כמו וירוס BK-polyדונים (BKPyV), יכול לגרום לפתווגיות חמורות בחולים חיסוני. עם זאת, מאז אנטי ויראלים יעילים מאוד אינם זמינים כרגע, שיטות מדידת ההשפעה של סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים נדרשים. כאן, כתב פלואורסצנטית כפול המאפשר ניתוח של BKPyV שאינו קידוד בקרת האזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות יזם נבנה כדי לכמת את ההשפעה של תרופות אנטי ויראליות פוטנציאליים על ביטוי גנים נגיפי באמצעות tdTomato ו eGFP ביטוי. בנוסף, על ידי שיבוט BKPyV-NCCR הגברה אשר בפרוטוקול זה שהתקבלו בעבר מן ה-DNA הנגזר דם של חולי חיסוני מושתלים כליות, ההשפעה של NCCR-סידור מחדש על ביטוי גנים ויראלי ניתן לקבוע. בעקבות השיבוט של המטופל הופק הגברה, תאים HEK293T היו מזוהמים העיתונאי-פלמידים, וטיפל עם סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים. לאחר מכן, התאים היו חשופים FACS-ניתוח עבור מדידת ממוצע עוצמות זריחה 72 h לאחר התיקון. כדי לבדוק גם את הניתוח של תרופות כי יש מחזור התא פוטנציאלי השפעה מעכבת, רק מנוכר ובכך תאי פלורסנט משמשים. מאחר שהבדיקה מבוצעת בתאי T אנטיגן ביטוי גדול, ההשפעה של ביטוי מוקדם ומאוחר ניתן לנתח בצורה עצמאית הדדית.

בניסוי מייצג זה, אזור הבקרה של וירוס BK-פולידוני שאינו קידוד מונחה הפעילות הטרנסדטית נמדדה באמצעות הזרימה cy, try. בנוסף, מעכב mTOR, אשר עשוי לשמש לטיפול בחולים אחרי BKPyV ההפעלה מראש, נבדק על העיכוב שלה של הביטוי הגן הקדומה ויראלי. למטרה זו, שימש שיטת הכתבת הפלואורסצנטית כפולה כפי...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות

בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא למדוד BK-polyomavirus אזור בקרת אי קידוד מונע פעילות שעתוק על ידי מדידת תאים פלואורסצנטיים כפולים באמצעות ציטומטריית זרימה. BK-polyomavirus יכול לגרום פתולוגיות חמורות בחולים immunocompromised, במיוחד אצל מושתלי כליות. עם זאת, מאז אנטי וירוס יעיל מאוד אינם זמינים כיום, שיטות מדידת ההשפעה האנטי ויראלית הפוטנציאלית של תרכובות אחרות נדרשים.שיטה זו מאפשרת לווירולוגים לנתח את ההשפעה של סוכנים אנטי ויראליים פוטנציאליים המשפיעים על פעילות שעתוק BK-polyomavirus המונעת על ידי אזור הבקרה שאינו קידוד. בדיקה זו מאפשרת עוד יותר לחקור את ההשפעה של סידורים מחדש על פעילות האמרגן בהשוואה לאזורי בקרה ארכיטיפיים שאינם קידוד. היתרון של לימוד פעילות האמרגן הוויראלי עם דו"ח פלואורסצנטי כפול הוא שניתן לנתח ביטוי גנים מוקדם ומאוחר באופן עצמאי הדדי.יתר על כן, ניקוב קשה של מניות וירוסים וניסויים ארוכי טווח בתרבות תאים זיהומיות אינם נחוצים שכן רק תאים מדבקים ופלורסנט מנותחים, גם תרופות המפחיתות את הכדאיות של התאים וניקוב ניתן ללמוד. פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות המחקר האנושי כפי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה הרפואית של אוניברסיטת דואיסבורג-אסן. הצעד הראשון הוא לאסוף דגימות דם לבידוד של דנ"א פוליו-וירוס.לאסוף לפחות שלושה מיליליטר של דם בצינורות רכישת EDTA. צנטריפוגה המדגם ב 2, 500 G במשך 15 דקות ו pipette הפלזמה לתוך צינור חדש. הכינו 40 מיקרוליטרים של חלבון SK לצינור מיקרו-צנטריפוגה בגודל 1.5 מיליליטר והוסיפו 400 מיקרוליטר פלזמה על ידי צינורות.לבודד את ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי כתם DNA כמתואר בהוראות היצרן. הכינו את התערובת הראשית לקדם-PCR באמצעות זוג פריימר A בנפח כולל של 50 מיקרוליטרים ולהשתמש בדנ"א המבודד בעבר. הפץ 45 מיקרוליטרים של התערובת הראשית לתוך צינורות PCR.הוסף חמישה microliters של DNA מבודד לתוך צינורות PCR ולהפעיל את PCR עם תנאי התגובה כפי שמודגם בטבלה שלוש. חזור על חישול denaturation והרחבה ב 35 מחזורים. עבור יישום מקונן, השתמש בזוג פריימר B, המטפח את אתרי ההגבלה לשיבוט.מערבבים 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינת ג'ל פי שישה. טוענים 10 מיקרוליטרים של התערובת על ג'ל 1.5% agarose ולהפעיל את הג'ל במשך 30 דקות ב 60 מיליאמפר. דמיינו את הג'ל בעזרת מערכת תיעוד UV מתאימה.לטהר את אמפיליקונים PCR באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן. לעכל את amplicons מטוהרים עם אנזימי הגבלת מחוון במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלבי הטיהור כדי לטהר את האמפליקונים המתעכלים.במקביל, גם לעכל את עמוד השדרה פלסמיד. לנתח את עמוד השדרה פלסמיד מתעכל על 0.8% הר נמוך ג'ל אגרוז. אין להפעיל את הג'ל בזרם גבוה יותר מ-40 מיליאמפר.דמיינו שברי דנ"א בעזרת אור UV בגל ארוך וחתכו את עמוד השדרה כפוף באמצעות אזמל נקי. יש להימנע פעמים ארוכות מחשיפה לקרינת UV כדי למנוע נזק לדנ"א. גדר לחתיכת שבר ג'ל פלומל לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.מחממים את עמוד השדרה המכיל חתיכת אגרוז במצב נמוך במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס על מנת להמיס את חתיכת הג'ל ומערבבים כל שתי דקות על ידי מערבולת עדינה. ג'ל מומס יכול לשמש ישירות עבור קשירה. עמוד השדרה של Ligate והאמפליקון המתעכל באמצעות ליגת ה-DNA T4 למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס.לאחר הליך שיבוט סטנדרטי, לבודד את ה-DNA פלזמה. בצע עיכול אנזים הגבלה כדי לבדוק שיבוטים חיוביים לדמיין שברים מתעכלים על 1%agarose ג'ל. זרעים 100, 000 HEK293T תאים לכל באר של 12 צלחת באר 24 שעות לפני transfection ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לשמור על התפשטות פעילה במהלך transfection.התאים צריכים להיות בערך ב-80%confluency בעת ביצוע חילוף. מניחים 250 microliters של מדיה סרום מופחת בצינור סטרילי ולהוסיף מיקרוגרם אחד של כל DNA פלזמה דיווח לערבב בעדינות על ידי צינורות. מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של רגנט ההטרמפקט לתערובת הדנ"א ומערבבים בעדינות על ידי צינורות ודגירה במשך 15 דקות ב-22 מעלות צלזיוס.מוסיפים את התערובת, טיפה חכם לגם בעדינות להפיץ לגם. לאחר ארבע שעות, החלף את העל-טבעי במדיום טרי המכיל את סוכני הבדיקה ואת בקרת הממסים. בדוגמה זו, מעכבי mTOR INK-128 ו rapamycin שימשו.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד ניתוח. בדוק תאים עבור פלואורסצנטיות אדומה וירוקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלואורסצנטיות אדומה וירוקה תואמת את ביטוי הגן BK-polyomavirus המוקדם והמאוחר בהתאמה.72 שעות לאחר ההתעלות, בזהירות לשאוף את supernatant. לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר. מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטרים ומסובבים מעט את הצלחת כדי למנוע ניתוק מוקדם של התאים.שלב זה חשוב כדי למנוע כפילומות תאים. לאחר הוספת, טריפסין מוסר ישירות עם אותו טיפ פיפטה. דגירה התאים לפחות חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.השהה מחדש את תאי טריפסין S עם PBS מיליליטר אחד המכיל 3%FCS והעבר את ההשעיה בצינורות FACS עם תווית מראש. הוסף DAPI בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר לפני ניתוח FACS. לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.עבור כל מדגם, למדוד לפחות 10,000 תאים חיים. פיצוי ראשוני חיוני כדי להבחין אותות אדומים וירוקים כדי להשיג תוצאות מדויקות. מנהל הבקרה שאינו קידוד הוגבר באמצעות פרוטוקול PCR מקונן באמצעות זוג פריימר הפנימי אשר מחסה אתרי ההגבלה לשיבוט.אימות האמפליקון בוצע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בעוד שהאמפליקונים שמקורם ברצפי NCCR ארכיטיפיים בחלוקת גודל הומופובית בג'ל, אלה שמקורם ב- NCCRs מסודרים מחדש עם הכנסות ומחיקות, היו שונים בגודלם. בחירת שיבוטים חיוביים המכילים את NCCR אומתה על-ידי ניתוח הגבלה. אזור הרווח הקטן הוחלף על-ידי שברי NCCR גדולים יותר המציינים שיבוטים חיוביים.דנ"א פלסמיד מבודד משבבוטים מאומתים נשלחו לפירוזקווינקינג. בדוגמה זו זוהתה המחיקה בבלוק P וההחלפה בבלוק O. תאי HEK293T נותפו באופן ארעי עם הכבוד לבנייה הניתנת לדיווח ופעילות NCCR הייתה במעקב על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.פלואורסצנטיים אדומים וירוקים התאים לביטוי גנים BK-polyomavirus מוקדם ומאוחר בהתאמה. NCCR הראשון הציג ביטוי גנים מאוחר חזק בעוד הדוגמה השנייה היה חזק יחסית מוקדם אך מתון ביטוי גנים מאוחר. תאים שליליים DAPI היו מגודרים ועלילה נקודה נוצרה מראה eGFP לעומת tdTomato.דגימות שהיו שליליות, כמו גם אלה חיוביים עבור tdTomato או eGFP נכללו רק לתוך הניתוח. התעצמויות פלואורסצנטיות ממוצעות נגזרו מכל שיבוט בדיקה. בדוגמה זו, הטיפול עם מעכב mTOR כפול INK128 מופחת באופן משמעותי tdTomato MFI כלומר ביטוי מוקדם היה מעוכב.שיטה זו מאפשרת לזהות תרכובות בשימוש כיום ותרכובות אחרות כדי לזהות את BK-polyomavirus באמצעות פעילות שעתוק. בביטוי גנים מוקדם, זה בהחלט קובע את המשמעות הנגיפית. טיפות מעכבות עשוי להיחשב לשמש כסוכנים עבור חולים immunocompromised במקרה של הפעלה מחדש של BK-polyomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג&#39;קין

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

הליך RNA הנפתח כדי לזהות מטרות RNA לונג ללא קידוד RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

תא המבוסס על מבחני של SINEUP ללא קידוד RNAs זה במיוחד יכולה לשפר את התרגום mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

באמצעות צלף-Cas9 כדי למזער את ההשפעות את המטרה של CRISPR-Cas9 ללא אובדן פעילות--היעד באמצעות אבולוציה מכוונת

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...