Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बारबरा Bleekmann धन्यवाद. इन अध्ययनों Duisburg-एस्सेन मेडिकल स्कूल के विश्वविद्यालय के IFORES कार्यक्रम और विश्वविद्यालय एलायंस Ruhr और Mercator अनुसंधान केंद्र Ruhr (MERCUR) के RIMUR कार्यक्रम द्वारा समर्थित थे. लेखक हेलेन Sertznig और लगातार समर्थन की डॉक्टरेट फैलोशिप के लिए जेरगेन-मंचोट-स्टिफटंग धन्यवाद. रोगी सामग्री के संग्रह और उपयोग विश्वविद्यालय Duisburg-Essen (14-6028-BO) के चिकित्सा संकाय की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.

इस प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान के दिशा निर्देशों के रूप में Duisburg-Esen (14-6028-BO) विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय की नीति समिति द्वारा अनुमोदित के बाद.
1. रक्त या मूत्र के नमूनों का संग्रह और polyomavirus डीएनए के अ?...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

इस लेख में, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि प्रस्तुत किया है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर से प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. एनसीसीआर गतिविधि को एक साथ माप?...

Polyomaviruses एक प्रोटोटाइप प्रजातियों के रूप में Siman वायरस 40 (SV40) के साथ छोटे डबल-स्लेंड डीएनए (dsDNA) वायरस के एक स्वतंत्र परिवार का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्राथमिक संक्रमण मुख्य रूप से बचपन के दौरान होता है, जो आमतौर पर रोग के लक्षणों के बिना आगे बढ़ता है और आमतौर पर प्रतिरक्षा सक्षम मेजबानों में गुप्त संक्रमण का कारण बनता है। बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) मुख्य रूप से नेफ्रोपैथोलॉजिस्ट के कारण के बिना गुर्दे ट्यूबल कोशिकाओं में बनी रहती है, हालांकि, गुर्दे प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षा क्षमता की हानि के मामले में वायरस को पुनः सक्रिय कर सकते हैं और गंभीर नुकसान और बिगड़ा भ्रष्टाचार का कारण बन सकता है समारोह जब एक उच्च viremia तक पहुँचने (1 x 104 BKPyV डीएनए प्रतियां / गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के लगभग 10% में, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) के पुनः सक्रियण एक polyomavirus जुड़े नेफ्रोपैथी (PyVAN) मेंपरिणाम है, जो 80% गुर्दे allograft विफलताओं के एक उच्च जोखिम के साथ जुड़े 3,4 . चूंकि कोई अनुमोदित एंटीवायरल एजेंट उपलब्ध नहीं हैं, वर्तमान चिकित्सा इम्यूनोसुप्रेशन की कमी पर आधारित है। दिलचस्प बात यह है कि, MTOR अवरोधकों का एंटीवायरल प्रभाव होता है; इस प्रकार, इम्युनोसुप्रेसिव थेरेपी को एम टी आर-आधारित इम्यूनोसुप्रेशन में बदलने से बीकेपीवी विरेमिया5,6,7की प्रगति को रोकने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व हो सकता है। हालांकि, MTOR आधारित एंटीवायरल तंत्र वर्तमान में अभी भी अधूरा समझ में आ गया है. इस प्रकार, नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है।
BKPyV के परिपत्र जीनोम लगभग 5 केबी एक गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) है कि प्रतिकृति और संयोग से एक द्विदिश प्रमोटर जल्दी और देर से चरण MRNA प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति ड्राइविंग के एक मूल के रूप में कार्य करता है शरण के होते हैं. स्वतः होने वाली NCCR-पुनर्व्यवस्थापन, विलोपन, और duplications रोगजनक BKPyV8 में पाए जाते हैं और काफी PVANसेपीड़ित रोगियों में जमा5 ,9, आर्केटाइपिक (डब्ल्यूटी) की तुलना और पुन: व्यवस्थित (आरआर) एनसीसीआर-कार्यकलाप वायरल प्रतिकृति फिटनेस की विशेषता के लिए सहायक होते हैं।
जैसा कि चित्र 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है , यह प्रोटोकॉल बीकेपीवी एनसीसीआर ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को मापने के लिए सामान्य रूप से प्रयुक्त विधि का वर्णन करता है, जो दो फ्लोरोफोर्स tdTomato और eGFP के फ्लोरोसेंट को मापने के लिए एक रिपोर्टर प्लाज्मिड5से व्यक्त किया जाता है, 9,10,11. प्रक्रिया SV40 बड़े टी प्रतिजन (lTAg) की उपस्थिति में किया जाता है, जो जल्दी और देर से NCCR-सक्रियता पर संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देता है अलग से5. यह परख आगे एनसीसीआर गतिविधि पर पुनर्व्यवस्था ओंकारने के प्रभाव और डब्ल्यूटी-एनसीसीआर5,9 के साथ तुलना का विश्लेषण करतीहै. रिपोर्टर प्लाज्मिड क्रमशः tdTomato और eGFP के लिए दोनों प्रतिलिपि के तुलनीय और कुशल प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक fluorophore खुला पढ़ने फ्रेम के बहाव SV40 देर polyadenylation संकेत बंदरगाह. QRT-पीसीआर आधारित तरीकों की तुलना में5,12, इस FACS आधारित दृष्टिकोण संक्रमित सेल संस्कृति और कोई महंगा के लिए कोई जटिल निष्कर्षण प्रोटोकॉल के बाद से एक कम लागत और उच्च थ्रूपुट संगत विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है प्रतिरक्षा फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए एंटीबॉडी की जरूरत है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की एक परिभाषित राशि प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं के बाद से, सेल चक्र बाधा एजेंटों का विश्लेषण भी एक मात्रात्मक तरीके से संभव है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Polyomaviruses, बीके-पॉलीओमावायरस (BKPyV) की तरह, प्रतिरक्षा समझौता रोगियों में गंभीर रोगों का कारण बन सकता है। हालांकि, चूंकि अत्यधिक प्रभावी एंटीवायरल वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं, इसलिए संभावित एंटीवायरल एजेंटों के प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है। यहाँ, एक दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर है कि BKPyV गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र (NCCR) जल्दी और देर प्रमोटर गतिविधि संचालित के विश्लेषण की अनुमति देता है tdTomato और eGFP के माध्यम से वायरल जीन अभिव्यक्ति पर संभावित एंटीवायरल दवाओं के प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए निर्माण किया गया था अभिव्यक्ति. इसके अलावा, बीकेपीवी-एनसीसीआर एम्प्लियन्स की क्लोनिंग करके, जो इस प्रोटोकॉल में प्रतिरक्षा-संपीड़ित गुर्दे के प्रतिरोपित रोगियों के रक्त व्युत्पन्न डीएनए से प्राप्त किए गए हैं, वायरल जीन अभिव्यक्ति पर एनसीसीआर-पुनर्व्यवस्थाओं के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। रोगी व्युत्पन्न amplicons की क्लोनिंग के बाद, HEK293T कोशिकाओं रिपोर्टर-प्लास्मिड के साथ transfected थे, और संभावित एंटीवायरल एजेंटों के साथ इलाज किया. बाद में, कोशिकाओं को माध्य फ्लोरोसेंट तीव्रता 72 एच पोस्ट ट्रांसफेक्शन को मापने के लिए FACS-विश्लेषण के अधीन किया गया। यह भी दवाओं है कि एक संभावित सेल चक्र बाधा प्रभाव है के विश्लेषण का परीक्षण करने के लिए, केवल transfected और इस तरह फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है. चूंकि इस परख बड़े टी Antigen व्यक्त कोशिकाओं में किया जाता है, जल्दी और देर से अभिव्यक्ति के प्रभाव को एक पारस्परिक रूप से स्वतंत्र तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है.

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, BK-polyomavirus गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से मापा गया था. इसके अलावा, एक MTOR अवरोध करनेवाला, जो BKPyV पुनः सक्रिय?...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

बीके-पॉलीओमावायरस गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि वाया फ्लो साइटोमेट्री का मापन

इस पांडुलिपि में, एक प्रोटोकॉल एक द्विदिश रिपोर्टर प्लाज्मिड tdTomato और eGFP व्यक्त करने के साथ transfected HEK293T कोशिकाओं का उपयोग करके बीके-पॉलीओमावायरस ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के FACS आधारित माप प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत किया है। इस विधि को आगे मात्रात्मक वायरल प्रतिलेखन पर उपन्यास यौगिकों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

इस प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से दोहरी फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को मापने के द्वारा बीके-पॉलीओमावायरस गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र संचालित ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को मापना है। बीके-पॉलीओमावायरस इम्यूनोसमझौता रोगियों में गंभीर विकृतियों का कारण बन सकता है, विशेष रूप से गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में । हालांकि, चूंकि अत्यधिक प्रभावी एंटीवायरस वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं, अन्य यौगिकों के संभावित एंटी-वायरल प्रभाव को मापने के तरीकों की आवश्यकता है।यह विधि विषाणुविज्ञानियों को गैर-कोडिंग नियंत्रण क्षेत्र द्वारा संचालित बीके-पॉलीओमावायरस ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को प्रभावित करने वाले संभावित एंटी-वायरल एजेंटों के प्रभाव का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। यह परख आगे ठेठ गैर कोडिंग नियंत्रण क्षेत्रों की तुलना में प्रमोटर गतिविधि पर पुनर्व्यवस्था के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है । दोहरी फ्लोरेसेंस रिपोर्ट के साथ वायरल प्रमोटर गतिविधि का अध्ययन करने का लाभ यह है कि प्रारंभिक और देर से जीन अभिव्यक्ति का पारस्परिक रूप से स्वतंत्र तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है।इसके अलावा, वायरस स्टॉक और दीर्घकालिक संक्रामक सेल संस्कृति प्रयोगों का कठिन छिद्र आवश्यक नहीं है क्योंकि केवल संक्रमित और फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाता है, कोशिका व्यवहार्यता और छिद्र को कम करने वाली दवाओं का भी अध्ययन किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान के दिशा-निर्देशों का पालन करता है जैसा कि ड्यूसबर्ग विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय की नीति समिति द्वारा अनुमोदित-एसेन । पहला कदम पॉलीओमावायरस डीएनए के अलगाव के लिए रक्त के नमूने एकत्र करना है।EDTA अधिग्रहण ट्यूबों में कम से कम तीन मिलीलीटर रक्त एकत्र करें। 15 मिनट के लिए 2, 500 ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र और एक नई ट्यूब में प्लाज्मा पिपेट। प्रोटीन एसके के 40 माइक्रोलीटर को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में तैयार करें और पाइपिंग करके 400 माइक्रोलीटर प्लाज्मा जोड़ें।निर्माता के निर्देशों में वर्णित डीएनए दाग निकासी किट का उपयोग करके डीएनए को अलग करें। 50 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में प्राइमर पेयर ए का उपयोग करके प्री-पीसीआर के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें और पहले से अलग डीएनए का उपयोग करें। पीसीआर ट्यूब में मास्टर मिक्स के 45 माइक्रोलीटर वितरित करें।पीसीआर ट्यूबों में अलग डीएनए के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और पीसीआर की स्थिति के साथ पीसीआर चलाने के रूप में तालिका तीन में सचित्र । 35 चक्रों में नाहटापन और विस्तार दोहराएं। नेस्टेड आवेदन के लिए, क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध साइटों को शरण देते हुए प्राइमर पेयर बी का उपयोग करें।पीसीआर प्रोडक्ट के 10 माइक्रोलीटर को छह फोल्ड जेल लोडिंग डाई के दो माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं। 1.5% एगर उठे जेल पर मिश्रण के 10 माइक्रोलीटर लोड करें और 60 मिलीपेरे पर 30 मिनट के लिए जेल चलाएं। एक उपयुक्त यूवी दस्तावेज प्रणाली का उपयोग करके जेल की कल्पना करें।निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर एम्प्लीकोन को शुद्ध करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए संकेतक प्रतिबंध एंजाइमों के साथ शुद्ध एम्प्लिकॉन को पचाएं। पचाए गए एम्प्लिकॉन को शुद्ध करने के लिए शुद्धि चरणों को दोहराएं।समानांतर में, प्लाज्मिड बैकबोन को भी पचाएं। 0.8% कम माउंट एगर उठे जेल पर पचा हुआ प्लाज्मिड बैकबोन का विश्लेषण करें। 40 मिलीपेरे से अधिक धारा पर जेल न चलाएं।लंबी लहर यूवी प्रकाश का उपयोग कर डीएनए टुकड़े कल्पना और एक साफ स्केलपेल का उपयोग कर रीढ़ तुला बाहर काट दिया । डीएनए क्षति को रोकने के लिए लंबे यूवी एक्सपोजर समय से बचें। एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रो-अपकेंद्रित्र ट्यूब में फ्लॉमेल जेल टुकड़े के टुकड़े के लिए बाड़।जेल के टुकड़े को पिघलाने और कोमल भंवर द्वारा हर दो मिनट में मिलाने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कम मोड एगर उठे टुकड़े से युक्त रीढ़ को गर्म करें। पिघले हुए जेल का उपयोग सीधे लिगेशन के लिए किया जा सकता है। लिगेट रीढ़ और पचा एम्प्लिकॉन T4 डीएनए ligase का उपयोग कर रात भर 16 डिग्री सेल्सियस पर ।मानक क्लोनिंग प्रक्रिया के बाद, प्लाज्मा डीएनए को अलग करें। सकारात्मक क्लोन की जांच करने और 1% एगर उठे जेल पर पचाने वाले टुकड़ों की कल्पना करने के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन करें। बीज 100, 000 HEK293T कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से 12 अच्छी तरह से थाली के प्रति 24 घंटे से पहले ट्रांसफैक्शन और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट, ट्रांसफैक्शन के दौरान सक्रिय प्रसार बनाए रखने ।कोशिकाओं को ट्रांसफैक्शन पर लगभग 80% संकुचन पर होना चाहिए। बाँझ ट्यूब में कम सीरम मीडिया के २५० माइक्रोलीटर रखें और प्रत्येक रिपोर्ट प्लाज्मा डीएनए के एक माइक्रोग्राम जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे मिलाएं । डीएनए मिश्रण में ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के तीन माइक्रोलीटर जोड़ें और 22 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा धीरे से मिलाएं।मिश्रण जोड़ें, कुएं में ड्रॉप-वार करें और धीरे-धीरे कुएं में वितरित करें। चार घंटे के बाद, सुपरनेट को टेस्टिंग एजेंटों और सॉल्वेंट कंट्रोल युक्त ताजा माध्यम से बदलें। इस उदाहरण में, एमटीआरएर अवरोधक इंक-128 और रैपामाइसिन का उपयोग किया गया था।विश्लेषण तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत लाल और हरे फ्लोरेसेंस के लिए कोशिकाओं की जांच करें। लाल और हरे रंग की फ्लोरेसेंस क्रमशः प्रारंभिक और स्वर्गीय बीके-पॉलीओमावायरस जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप है।72 घंटे ट्रांसफैक्शन के बाद, ध्यान से सुपरनैंट की ख्वाहिश करें। कोशिकाओं को ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं। धीरे-धीरे 500 माइक्रोलीटर ट्राइप्सिन जोड़ें और कोशिकाओं की समय से पहले टुकड़ी से बचने के लिए प्लेट को थोड़ा चालू करें।सेल डबल्स से बचने के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ट्राइपसिन को सीधे उसी पिपेट टिप से हटा दिया जाता है। कोशिकाओं को कम से कम पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।3% एफसीएस युक्त एक मिलीलीटर पीबीएस के साथ ट्राइपसिन एस कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और पूर्व-लेबल वाले FACS ट्यूबों में निलंबन स्थानांतरित करें। FACS विश्लेषण से पहले एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर DAPI जोड़ें। एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं का विश्लेषण करें।प्रत्येक नमूने के लिए, कम से कम 10, 000 जीवित कोशिकाओं को मापें। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए लाल और हरे संकेतों को अलग करने के लिए प्रारंभिक मुआवजा आवश्यक है। गैर-कोडिंग नियंत्रण रीजेंट को आंतरिक प्राइमर जोड़ी का उपयोग करके नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था जो क्लोनिंग के लिए प्रतिबंध साइटों को बंदरगाहों।एम्प्लिकॉन सत्यापन एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से किया गया था जबकि जेल में एक समरूप आकार वितरण पर ठेठ एनसीसीआर दृश्यों से प्राप्त एम्प्लिकलन, सम्मिलन और विलोपन के साथ पुनर्व्यवस्थित एनसीसीआर से प्राप्त, उनके आकार में भिन्न थे। एनसीसीआर युक्त सकारात्मक क्लोनों का चयन प्रतिबंध विश्लेषण द्वारा सत्यापित किया गया था। छोटे स्पेसर क्षेत्र को सकारात्मक क्लोन का संकेत देने वाले बड़े एनसीसीआर टुकड़ों द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था।सत्यापित क्लोन से अलग प्लाज्मिड डीएनए को पायरोसक्वेंसी के लिए भेजा गया था । इस उदाहरण में पी-ब्लॉक में विलोपन और ओ-ब्लॉक में प्रतिस्थापन का पता चला । HEK293T कोशिकाओं को क्षणिक रूप से रिपोर्ट करने योग्य निर्माण के सम्मान से संक्रमित किया गया था और एनसीसीआर गतिविधि की निगरानी फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी।लाल और हरे फ्लोरोसेंट क्रमशः जल्दी और स्वर्गीय बीके-पॉलीओमावायरस जीन अभिव्यक्ति के अनुरूप थे। पहले एनसीसीआर ने एक मजबूत देर से जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शित की जबकि दूसरे उदाहरण में तुलनात्मक रूप से मजबूत जल्दी लेकिन मध्यम देर से जीन अभिव्यक्ति थी । DAPI नकारात्मक कोशिकाओं gated थे और एक डॉट प्लॉट eGFP बनाम tdTomato दिखा बनाया गया था ।नमूने जो नकारात्मक थे और साथ ही टीडीटोमाटो या ईजीएफपी के लिए सकारात्मक थे, केवल विश्लेषण में शामिल किए गए थे। प्रत्येक परीक्षण क्लोन से औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता प्राप्त की गई थी। इस उदाहरण में, दोहरी mTOR अवरोधक INK128 के साथ उपचार काफी tdTomato MFI जिसका अर्थ है कि जल्दी अभिव्यक्ति बाधित किया गया था कम ।यह विधि ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के माध्यम से बीके-पॉलीओमावायरस का पता लगाने के लिए वर्तमान में उपयोग किए गए और अन्य यौगिकों की पहचान करने की अनुमति देती है। प्रारंभिक जीन अभिव्यक्ति में, यह निश्चित रूप से वायरल निहितार्थ निर्धारित करता है। निरोधात्मक बूंदों को बीके-पॉलीओमावायरस पुनर्सक्रियण के मामले में इम्यूनोसमझौता रोगियों के लिए एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

शास्त्रीय हॉजकिन लिम्फोमा के रीड-स्टर्नबर्ग कोशिकाओं के प्रवाह-छंटनी और एक्जी सेक्शनिंग

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

डीएनए सामग्री माप द्वारा स्तनधारी प्रतिकृति समय के जीनोम चौड़ा निर्धारण

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

आरएनए Pull-डाउन प्रक्रिया एक लंबी गैर-कोडिंग आरएनए के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

सेल SINEUP गैर कोडिंग RNAs है कि विशेष रूप से mRNA अनुवाद में वृद्धि कर सकते है आधारित परख

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

का उपयोग निशानची-Cas9 का लक्ष्य कम करने के लिए crispr-Cas9 के नुकसान के बिना निर्देशित विकास के माध्यम से पर लक्ष्य गतिविधि की हानि के लिए

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

एनेउप्लॉयडी के लिए प्रीमेंप्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग के लिए सेमीकंडक्टर अनुक्रमण

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaवायरसों का पता लगाने के लिए एक सार्वभौमिक नेस्टेड रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन Polymerase चेन रिएक्शन का मूल्यांकन

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

कृत्रिम आरएनए पॉलिमरेज द्वितीय विस्तार परिसर को-ट्रांसक्रिप्शनल आरएनए प्रोसेसिंग इवेंट्स को अलग करने के लिए

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...