Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Gli autori ringraziano Barbara Bleekmann per l'eccellente assistenza tecnica. Questi studi sono stati sostenuti dal programma IFORES della Scuola Medica dell'Università di Duisburg-Essen e dal programma RIMUR dell'Alleanza dell'Alleanza universitaria Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Gli autori ringraziano il J'rgen-Manchot-Stiftung per la borsa di dottorato di Helene Sertznig e il supporto costante. La raccolta e l'uso del materiale per il paziente è stato approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Raccolta di campioni di sangue o urina e isolamento del DNA poliomavirus
<ol><li>Raccogliere almeno 3 mL di sangue in tubi EDTA o urina in tubi di acquisizione.</li>
	<li>Centrifugare il campione a 2.500 x g per 15 min. Se necessario, pipetta plasma in un nuovo tubo e conservare i campioni di plasma a 4 gradi cen...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

In questo articolo viene presentato un metodo comunemente usato che consente l'analisi dell'attività BKPyV di controllo non codificante (NCCR) guidata in anticipo e in ritardo. L'attività NCCR può essere misurata simultaneamente e non necessita di lisi delle cellule trafette. Inoltre, è possibile analizzare un numero relativamente elevato di cellule e non è necessaria la co-trasfezione di marcatori aggiuntivi per la normalizzazione dei valori di fluorescenza.
Una parte fondamentale di que...

I poliomavirus rappresentano una famiglia indipendente di piccoli virus di DNA a doppio filamento (dsDNA) con il virus Simian 40 (SV40) come specie prototipo. L'infezione primaria si verifica principalmente durante l'infanzia, che di solito procede senza sintomi di malattia e di solito causano infezioni latenti in ospiti immunitari competenti. Il BK-poliomavirus (BKPyV) persiste principalmente nelle cellule dei tubuli renali senza causare nefropatologie, tuttavia, in caso di compromissione della competenza immunitaria dopo il trapianto renale il virus può riattivarsi e causare gravi danni e alterati innesti quando si raggiunge una viremia alta (1 x 104 BKPyV copie di DNA/mL)1,2. In circa il 10% dei destinatari del trapianto di rene, la riattivazione del bK-poliomavirus (BKPyV) si traduce in un poliomavirus associato a nefropatia (PyVAN), che è stato fino all'80% associato ad un alto rischio di fallimenti di allotrapianto renale3,4 . Poiché non sono disponibili agenti antivirali approvati, la terapia attuale si basa sulla riduzione dell'immunosoppressione. È interessante notare che gli inibitori di mTOR sembrano avere un effetto antivirale; pertanto, il passaggio della terapia immunosoppressiva all'immunosoppressione a base di mTOR potrebbe rappresentare un approccio alternativo per prevenire la progressione della viremia BKPyV5,6,7. Tuttavia, il meccanismo antivirale basato su mTOR è attualmente ancora incompleto. Pertanto, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali in concentrazioni clinicamente rilevanti.
Il genoma circolare del BKPyV è costituito da circa 5 kb che ospitano una regione di controllo non codificante (NCCR) che funge da origine della replicazione e concomitante un promotore bidirezionale che guida l'espressione di trascrizioni di mRNA di fase precoce e tardiva. Poiché si verificano spontaneamente riarrangiamenti, delezioni e duplicazioni di NCCR si trovano in BKPyV8 patogeni e significativamente accumulati in pazienti affetti da PVAN5,9, un confronto di archetipico (wt) e ri-organizzato (rr) NCCR-attività sono utili per caratterizzare la forma replicativa virale.
Come riassunto nella Figura 1, questo protocollo descrive un metodo comunemente usato per misurare l'attività trascrizionale BKPyV NCCR quantificando la fluorescenza di due fluorofori tdTomato ed eGFP espressi da un plotone reporter5, 9,10,11. La procedura viene eseguita in presenza del grande antigene T SV40 (lTAg), che permette di analizzare separatamente l'impatto di potenziali agenti antivirali sulla attività NCCR precoce e tardiva 5 . Questo analisi analizza ulteriormente l'impatto dei riarrangiamenti sull'attività della NCCR e il confronto con wt-NCCR5,9. Il plotone reporter ospita il segnale di poliadenilazione tardiva SV40 a valle di ogni telaio di lettura aperto del fluoroforo per garantire un'elaborazione comparabile ed efficiente di entrambe le trascrizioni per tdTomato ed eGFP, rispettivamente. Rispetto ai metodi basati su qRT-PCR5,12, questo approccio basato su FACS rappresenta un'alternativa compatibile a basso costo e ad alta velocità effettiva poiché nessun protocollo di estrazione complicato per la coltura cellulare infetta e non costoso anticorpi per la colorazione della fluorescenza immunitaria. Inoltre, poiché una quantità definita di cellule fluorescenti viene analizzata tramite la citometria di flusso, l'analisi degli agenti inibitori del ciclo cellulare è possibile anche in modo quantitativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

I poliomavirus, come il BK-poliomavirus (BKPyV), possono causare gravi patologie nei pazienti immunocompromessi. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirali altamente efficaci, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali. Qui, è stato costruito un reporter a doppia fluorescenza che consente l'analisi dell'attività di promotrice bKPyV basata sulla regione di controllo non codificante (NCCR) in anticipo e in ritardo per quantificare l'impatto di potenziali farmaci antivirali sull'espressione genica virale tramite tdTomato ed eGFP espressione. Inoltre, clonando gli amplificatori BKPyV-NCCR che in questo protocollo sono stati esemplificati dal DNA derivato dal sangue dei pazienti trapiantati renali immunocompromessi, è possibile determinare l'impatto dei riarrangiamenti NCCR sull'espressione genica virale. Dopo la clonazione del paziente derivato amplicons, le cellule HEK293T sono state trascate con il reporter-plasmidi e trattate con potenziali agenti antivirali. Successivamente, le cellule sono state sottoposte all'analisi FACS per misurare le intensità medie di fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Per testare anche l'analisi dei farmaci che hanno un potenziale effetto di inibizione del ciclo cellulare, vengono utilizzate solo cellule trasfette e quindi fluorescenti. Poiché questo saggio viene eseguito in grandi cellule che esprimono l'antigene T, l'impatto dell'espressione precoce e tardiva può essere analizzato in modo reciprocamente indipendente.

In questo esperimento rappresentativo, l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificabil Inoltre, un inibitore mTOR, che potrebbe essere usato per trattare i pazienti dopo la riattivazione di BKPyV, è stato testato per la sua inibizione dell'espressione genica precoce virale. A tal fine, un saggio a doppia fluorescenza-reporter è stato utilizzato come pubblicato in precedenza5. Lo schema di flusso di lavoro complessivo dell'installazio...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Misurazione di BK-poliomavirus Non-Coding Control Region Guidato Attività Trascrizionional Via Flusso Cytometry

In questo manoscritto, viene presentato un protocollo per eseguire la misurazione basata su FACS dell'attività trascrizionale BK-poliomavirus utilizzando cellule HEK293T trascate da un plasmide reporter bidirezionale che esprime tdTomato ed eGFP. Questo metodo permette inoltre di determinare quantitativamente l'influenza di nuovi composti sulla trascrizione virale.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è misurare l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificante BK-polyomavirus misurando due celle fluorescenti tramite citometria a flusso. Il BK-poliomavirus può causare gravi patologie nei pazienti immunocompro compromessi, specialmente nei riceventi di trapianti renali. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirus altamente efficaci, sono necessari metodi che misurino il potenziale impatto antivirali di altri composti.Questo metodo consente ai virologi di analizzare l'impatto di potenziali agenti antivirali che influenzano l'attività trascrizionale del BK-poliomavirus guidata dalla regione di controllo non codificante. Questo saggio consente inoltre di studiare l'influenza dei riarrangiamenti sull'attività del promotore rispetto alle regioni archetipiche di controllo non codificanti. Il vantaggio di studiare l'attività del promotore virale con un rapporto di doppia fluorescenza è che l'espressione genica precoce e tardiva può essere analizzata in modo reciprocamente indipendente.Inoltre, la difficile perforazione delle scorte virali e gli esperimenti di coltura cellulare infettiva a lungo termine non sono necessari poiché vengono analizzate solo le cellule trasfette e fluorescenti, è possibile studiare anche farmaci che riducono la vitalità cellulare e la perforazione. Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana approvate dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen. Il primo passo è raccogliere campioni di sangue per l'isolamento del DNA del poliomavirus.Raccogliere almeno tre millilitri di sangue in tubi di acquisizione EDTA. Centrifugare il campione a 2.500 G per 15 minuti e pipettare il plasma in un nuovo tubo. Preparare 40 microlitri di proteina SK in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 400 microlitri plasma mediante pipettaggio.Isolare il DNA utilizzando un kit di estrazione della macchia di DNA come descritto nelle istruzioni del produttore. Preparare il master mix per il pre-PCR utilizzando la coppia di primer A in un volume totale di 50 microlitri e utilizzare il DNA precedentemente isolato. Distribuire 45 microlitri del master mix nei tubi PCR.Aggiungere cinque microlitri del DNA isolato nei tubi PCR ed eseguire il PCR con le condizioni di reazione illustrate nella tabella tre. Ripetere la ricottura e l'estensione della denaturazione in 35 cicli. Per l'applicazione nidificata, utilizzare la coppia di primer B, che ospita i siti di restrizione per la clonazione.Mescolare 10 microlitri del prodotto PCR con due microlitri di colorante a caricamento in gel a sei pieghe. Caricare 10 microlitri della miscela su un gel di agarosio all'1,5% ed eseguire il gel per 30 minuti a 60 milliampere. Visualizzare il gel utilizzando un adeguato sistema di documentazione UV.Purificare gli ampliconi PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Digerire le ampliconi purificate con gli enzimi di restrizione degli indicatori per due ore a 37 gradi Celsius. Ripetere i passaggi di purificazione per purificare le ampliconi digerite.In parallelo, digerire anche la spina dorsale plasmide. Analizzare la spina dorsale plasmide digerita su un gel di agarosio a basso montaggio dello 0,8%. Non eseguire il gel a una corrente superiore a 40 milliampere.Visualizza i frammenti di DNA usando la luce UV ad onde lunghe e ritaglia la spina dorsale piegata usando un bisturi pulito. Evitare lunghi tempi di esposizione ai raggi UV per prevenire danni al DNA. Recinzione per il pezzo di frammento di gel di flomel in un nuovo tubo di micro-centrifuga da 1,5 millilitri.Riscaldare la spina dorsale contenente pezzo di agarosio in modalità bassa per 10 minuti a 65 gradi Celsius per sciogliere il pezzo di gel e mescolare ogni due minuti con un vortice delicato. Il gel fuso può essere utilizzato direttamente per la legatura. Spina dorsale ligata e amplicone digerito usando la ligasi del DNA T4 durante la notte a 16 gradi Celsius.Dopo la procedura di clonazione standard, isolare il DNA plasmatico. Eseguire la digestione enzimatica di restrizione per verificare la presenza di cloni positivi e visualizzare frammenti digeriti su un gel di agarosio all'1%. Le cellule di semi 100.000 HEK293T per pozzo della piastra di 12 pozzi 24 ore prima della trasfezione e dell'incubazione durante la notte a 37 gradi Celsius, mantengono la proliferazione attiva durante la trasfezione.Le cellule devono essere approssimativamente all'80% di confluenza alla trasfezione. Posizionare 250 microlitri di mezzi sieri ridotti in un tubo sterile e aggiungere un microgrammo di ogni DNA plasmatico riportato e mescolare delicatamente mediante pipettazione. Aggiungere tre microlitri del reagente di trasfezione alla miscela di DNA e mescolare delicatamente pipettando e incubando per 15 minuti a 22 gradi Celsius.Aggiungere la miscela, a goccia al pozzo e distribuire delicatamente al pozzo. Dopo quattro ore, sostituire il supernatante con un mezzo fresco contenente gli agenti di prova e il controllo del solvente. In questo esempio sono stati utilizzati gli inibitori mTOR INK-128 e rapamicina.Incubare a 37 gradi Celsius fino all'analisi. Controllare la presenza di fluorescenza rossa e verde al microscopio a fluorescenza. La fluorescenza rossa e verde corrispondono rispettivamente all'espressione genica BK-polyomavirus precoce e tardiva.72 ore dopo la trasfezione, aspirare con cura al supernatante. Lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS freddo. Aggiungere delicatamente 500 microlitri tripina e ruotare leggermente la piastra per evitare il distacco prematuro delle cellule.Questo passaggio è importante per evitare doppietti cellulari. Dopo l'aggiunta, la tripsiderina viene rimossa direttamente con la stessa punta della pipetta. Incubare le cellule per almeno cinque minuti a 37 gradi Celsius.Sospendere di nuovo le celle di trypsina S con un PBS millilitro contenente il 3%FCS e trasferire la sospensione in tubi FACS preetichettati. Aggiungere DAPI a una concentrazione di un microgrammo per millilitro prima dell'analisi FACS. Analizzare le celle utilizzando un citometro a flusso.Per ogni campione, misurare almeno 10.000 cellule viventi. La compensazione iniziale è essenziale per distinguere i segnali rossi e verdi per ottenere risultati accurati. Il reggente di controllo non codificante è stato amplificato utilizzando un protocollo PCR annidato utilizzando la coppia di primer interni che ospita i siti di restrizione per la clonazione.La verifica dell'amplicone è stata eseguita tramite elettroforesi del gel di agarosio Mentre gli ampliconi derivati da sequenze NCCR archetipiche ad una distribuzione omogenea delle dimensioni nel gel, quelle derivate da NCCR riarrangiati con inserimenti ed eliminazioni, differivano per le loro dimensioni. La selezione dei cloni positivi contenenti l'NCCR è stata verificata mediante analisi delle restrizioni. La piccola regione distanziale è stata sostituita dai frammenti NCCR più grandi che indicano cloni positivi.Il DNA plasmide isolato dai cloni verificati è stato inviato per il pirosioquenziamento. In questo esempio sono state rilevate l'eliminazione nel blocco P e la sostituzione in blocco O. Le cellule HEK293T sono state trasfette transitoriamente nel rispetto del costrutto segnalabile e l'attività NCCR è stata monitorata da una microscopia a fluorescenza.Le fluorescenti rosse e verdi corrispondevano rispettivamente all'espressione genica BK-polyomavirus precoce e tardiva. Il primo NCCR mostrava una forte espressione genica tardiva mentre il secondo esempio aveva un'espressione genica precoce ma moderata relativamente forte. Le celle negative DAPI sono state gated ed è stato creato un grafico a punti che mostra eGFP rispetto a tdTomato.Nell'analisi sono stati inclusi solo campioni negativi e positivi solo per tdTomato o eGFP. Le intensità media di fluorescenza sono state derivate da ogni clone di prova. In questo esempio, il trattamento con l'inibitore del doppio mTOR INK128 ha ridotto significativamente tdTomato MFI, il che significa che l'espressione precoce è stata inibita.Questo metodo consente di identificare i composti attualmente utilizzati e altri composti per rilevare il BK-poliomavirus attraverso l'attività trascrizionale. Nella prima espressione genica, questo determina decisamente l'implicazione virale. Le gocce inibitorie possono essere considerate come agenti per i pazienti immunocomprotiti nel caso della riattivazione del BK-poliomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Ricerca

Genetica

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinazione dei percorsi cromosomici ottimali per un elemento di DNA in Escherichia coli usando un approccio novello Transposon-mediata

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

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Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

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