Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
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著者らは、バーバラ・ブリークマンに優れた技術支援を感謝しています。これらの研究は、デュースブルク・エッセン大学医学部のIFORESプログラムと大学アライアンス・ルール・アンド・メルカトル研究センター・ルール(MERCUR)のRIMURプログラムによって支援されました。著者らは、ヘレネ・セルツニッヒの博士課程のフェローシップと絶え間ない支援に対して、ユルゲン・マンチョット・スティフトゥンに感謝しています。患者材料の収集と使用は、大学デュースブルクエッセン(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認されています。

このプロトコルは、デュースブルクエッセン大学(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います。
1. 血液または尿サンプルの採取とポリオマウイルスDNAの単離
<ol><li>EDTAチューブまたは取得チューブ内の尿中の血液の少なくとも3 mLを収集します。</li>
	<li>2,500 x gで15分間サンプルを遠心分離します。必要に応じて、ピペッ...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

本稿では、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする一般的に使用される方法が提示される。NCCR活性は同時に測定することができ、トランスフェクトされた細胞のリシスを必要としない。さらに、比較的多くの細胞を分析することができ、蛍光値の正規化のための追加マーカーの共トランスフェクションは必要ありません。
この?...

ポリオマウイルスは、シミアンウイルス40(SV40)をプロトタイプ種として有する小さな二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスの独立したファミリーを表す。一次感染は主に小児期に起こり、通常は疾患症状なしで進行し、通常は免疫有能な宿主で潜伏感染を引き起こす。BK-ポリオマウイルス(BKPyV)は、主に腎管細胞に腎症を引き起こすことなく持続するが、腎移植後の免疫能力の障害の場合、ウイルスは再活性化し、重度の損傷および移植片の障害を引き起こす可能性がある。高ウイルス血症(1 x 104 BKPyV DNAコピー/mL)1、2に達すると機能します。腎臓移植レシピエントのおよそ10%において、BK-ポリオマウイルス(BKPyV)の再活性化は、腎同種移植片障害のリスクが高い80%に関連したポリオマウイルス関連腎症(PyVAN)をもたらす3,4.承認された抗ウイルス剤が利用できないため、現在の治療は免疫抑制の減少に基づいている。興味深いことに、 mTOR 阻害剤は、抗ウイルス効果を持っているようです。;したがって、免疫抑制療法をmTORベースの免疫抑制に切り替えると、BKPyVウイルス血症5、6、7の進行を防ぐための代替アプローチを表しうる。しかし、mTORベースの抗ウイルス機構は現在まだ完全に理解されていない。したがって、臨床的に関連する濃度における潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が必要とされる。
BKPyVの円形ゲノムは、複製の起源として機能する非コード制御領域(NCCR)を約5kbに収容し、それに付き合って早期および後期mRNA転写物の発現を駆動する双方向プロモーターで構成される。自発的に発生するNCCR再配列、欠損、および複製は病原性BKPyV8に見出され、PVAN 5、9に苦しむ患者において有意に蓄積されるので、原型(wt)および再配置された(rr)NCCR活動は、ウイルス複製性の適合性を特徴付けるために有用である。
図1に要約すると、このプロトコルは、レポータープラスミド5から発現した2つの蛍光体tdTomatoおよびeGFPの蛍光を定量することにより、BKPyV NCCR転写活性を測定するために一般的に使用される方法を説明する。9,10,11.この手順は、SV40大型T抗原(lTAg)の存在下で行われ、これは、NCCR活性の早期および後期に対する潜在的な抗ウイルス剤の影響を別々に5に分析することを可能にする。このアッセイは、NCCR活性に対する再配置の影響とwt-NCCR5,9との比較をさらに分析する。レポータープラスミドは、各蛍敵オープンリーディングフレームの下流にあるSV40後期ポリアデニル化信号を、tdTomatoおよびeGFPの両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を保証します。qRT-PCRベースの方法5、12と比較して、このFACSベースのアプローチは、感染した細胞培養のための複雑な抽出プロトコルがなく、高価ではないため、低コストで高スループット対応の代替手段を表します。免疫蛍光染色のための抗体が必要です。さらに、フローサイトメトリーを介して定義された量の蛍光細胞を分析するので、細胞周期阻害剤の分析も定量的に可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

BK-ポリオマウイルス(BKPyV)のようなポリオマウイルスは、免疫不全患者に重篤な病理を引き起こす可能性がある。しかし、現在、非常に効果的な抗ウイルス剤は入手できないため、潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が求められている。ここでは、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする二重蛍光レポーターを構築し、tdTomatoおよびeGFPを介してウイルス遺伝子発現に対する潜在的な抗ウイルス薬の影響を定量化した。式。また、このプロトコルで例示的に得られたBKPyV-NCCRアンプリコンをクローニングすることにより、免疫不全の腎移植患者の血液由来DNAから得られ、NCCR再配列がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を判定することができる。患者由来アンプリコンのクローニング後、HEK293T細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトし、潜在的な抗ウイルス剤で治療した。続いて、細胞を平均蛍光強度72hポストトランスフェクションを測定するためのFACS分析を行った。また、潜在的な細胞周期阻害効果を有する薬物の分析をテストするために、トランスフェクトのみ、したがって蛍光細胞が使用される。このアッセイは大きなT抗原発現細胞で行われるので、早期発現と後期発現の影響を相互に独立した方法で分析することができる。

この代表的な実験では、BK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性をフローサイトメトリーを介して測定した。さらに、BKPyV再活性化後の患者の治療に使用される可能性のあるmTOR阻害剤を、ウイルス早期遺伝子発現の阻害について試験した。この目的のために、二重蛍光レポーターアッセイは、以前に公表された5として使用された。実験セ...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

このプロトコルの全体的な目的は、フローサイトメトリーを介して二重蛍光細胞を測定することによってBK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性を測定することである。BK-ポリオマウイルスは、免疫不全患者、特に腎移植レシピエントにおいて重篤な病態を引き起こす可能性がある。しかし、現在、高効率のウイルス対策が利用できないので、他の化合物の潜在的な抗ウイルス影響を測定する方法が必要です。この方法により、ウイルス学者は、非コード制御領域によって駆動されるBK-ポリオマウイルス転写活性に影響を及ぼす潜在的な抗ウイルス剤の影響を分析することができる。このアッセイは、非コード制御領域の典型的な非コード化領域と比較してプロモーター活性に対する再調整の影響をさらに研究することを可能にする。二重蛍光報告を用いてウイルスプロモーター活性を研究する利点は、早期および後期の遺伝子発現を相互に独立した方法で分析できることである。さらに、ウイルスストックや長期感染性細胞培養実験の難しい穿光は、トランスフェクトや蛍光細胞のみが解析されるため、また細胞の生存率や穿光を低下させる薬剤も検討できる。このプロトコルはデュースブルク・エッセン大学の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います.最初のステップは、ポリオマウイルスDNAの単離のための血液サンプルを収集することです。EDTA取得管に血液の少なくとも3ミリリットルを収集します。サンプルを2,500Gで15分間遠心し、プラズマを新しいチューブにピペットします。40マイクロリットルのプロテインSKを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに調製し、ピペット処理で400マイクロリットルのプラズマを加えます。メーカーの説明に記載されているように、DNAブロット抽出キットを使用してDNAを分離します。プライマーペアAを使用して50マイクロリットルの総体積でプリPCR用のマスターミックスを準備し、以前に単離されたDNAを使用します。45マイクロリットルのマスターミックスをPCRチューブに分配します。PCRチューブに5マイクロリットルの単離DNAを加え、表3に示すように反応条件でPCRを実行します。変性アニールと延長を35サイクルで繰り返します。ネストされたアプリケーションの場合は、プライマー ペア B を使用し、クローニング用の制限サイトを収容します。PCR製品の10マイクロリットルを、6倍のゲルローディング染料の2マイクロリットルと混合します。1.5%のアガロースゲルに10マイクロリットルのミックスをロードし、60ミランペアで30分間ゲルを実行します。適切な UV ドキュメント システムを使用してゲルを視覚化します。メーカーの指示に従って PCR 精製キットを使用して PCR アンプアイコンを精製します。37°Cで2時間の指標制限酵素で精製されたアンプリコンを消化します。消化されたアンプリコンを精製するために精製手順を繰り返します。並行して、プラスミド骨格も消化する。0.8%低マウントアガロースゲルで消化プラスミド骨格を分析します。ゲルを40ミリアンペアより高い電流で動かないでください。長波UV光を使用してDNA断片を可視化し、きれいなメスを使用して曲がった背骨を切り取ります。DNA損傷を防ぐため、紫外線の長時間の暴露を避けてください。新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管にフロメルゲル断片の部分のためのフェンス。ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜるために、低モードアガロース片を含む背骨を摂氏65度で10分間加熱します。溶融ゲルは、直接ライゲーションに使用することができる。リゲート骨格と16°Cで一晩T4 DNAリガーゼを使用して消化アンプリコン。標準的なクローニング手順の後、血漿DNAを分離する。制限酵素消化を行い、陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上で消化断片を可視化します。種子100,000 HEK293T細胞は、トランスフェクションの24時間前に12ウェルプレートのウェルあたり、摂氏37度で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性な増殖を維持する。細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエンシーである必要があります。250マイクロリットルの減らされた血清培地を無菌チューブに入れ、報告された各血漿DNAのマイクログラムを1マイクログラム加え、ピペットで穏やかに混ぜます。トランスフェクション試薬の3マイクロリットルをDNA混合物に加え、ピペット処理で穏やかに混ぜ、摂氏22度で15分間インキュベートします。混合物を加え、井戸に落とし、井戸にそっと分配します。4時間後、上清を試験剤および溶媒制御を含む新鮮な培地に交換してください。本例では、mTOR阻害剤INK-128およびラパマイシンを用いた。分析まで摂氏37度でインキュベートします。蛍光顕微鏡で細胞の蛍光と緑色を確認します。赤色および緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応する。トランスフェクション後72時間、上清を慎重に熱望する。冷たいPBSの1ミリリットルで細胞を2回洗います。500マイクロリットルのトリプシンを軽く加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。この手順は、セルのダブレットを避けるために重要です。添加後、トリプシンは同じピペットチップで直接除去される。37°Cで少なくとも5分間細胞をインキュベートする。3%FCSを含む1ミリリットルPBSでトリプシンS細胞を再中断し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移す。FACS分析の前に1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度でDAPIを追加します。フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。各サンプルについて、少なくとも10,000個の生細胞を測定する。正確な結果を得るためには、赤と緑の信号を区別するためには、初期補償が不可欠です。非コーディング制御リージェントは、クローニングのための制限部位を収容する内側プライマーペアを使用して、ネストされたPCRプロトコルを使用して増幅した。アンプリコン検証はアガロースゲル電気泳動を介して行ったが、ゲル内の均質なサイズ分布における典型的なNCCR配列に由来するアンプリコンは、挿入および欠失を伴う再配置されたNCCCrに由来するもので、その大きさが異なる。NCCRを含む陽性クローンの選択は、制限分析によって検証された。小さなスペーサー領域を、陽性クローンを示すより大きなNCCR断片に置き換えた。検証されたクローンから単離されたプラスミドDNAをピロシケンシングのために送った。この例では、Pブロック内の削除とOブロック内の置換が検出されました。HEK293T細胞は、一過性の報告可能な構築物に関する点でトランスフェクトされ、NCCR活性は蛍光顕微鏡でモニタリングした。赤色蛍光と緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応した。最初のNCCRは強い後期遺伝子発現を示し、2番目の例は比較的強い初期のが、中程度の後期遺伝子発現を有していた。DAPI陰性細胞をゲートし、eGFP対tdTomatoを示すドットプロットを作成した。tdTomatoまたはeGFPの場合にのみ陽性のサンプルと同様に陰性であったサンプルが分析に含まれていた。平均蛍光強度は、各試験クローンから導出された。この例では、二重mTOR阻害剤INK128による治療は、早期発現が阻害されたことを意味するtdTomato MFIを有意に低下させた。この方法は、転写活性を通じてBK-ポリマウイルスを検出するために現在使用されている他の化合物を同定することを可能にする。初期の遺伝子発現では、これはウイルスの意味を決定する。阻害低下は、BK-ポリマウイルス再活性化の場合に免疫不全患者の薬剤として使用されると考えられる。

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA プルダウン長い非コード RNA の RNA 標的を識別する手順

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...