Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

저자는 우수한 기술 지원을 바바라 블레크만 감사합니다. 이러한 연구는 뒤스부르크 - 에센 의과 대학의 IFORES 프로그램과 대학 얼라이언스 루르와 메르카토르 연구 센터 루르 (MERCUR)의 RIMUR 프로그램에 의해 지원되었다. 저자들은 헬렌 세르츠니그 박사의 펠로우십과 지속적인 지원에 대해 위르겐-만초-스티퉁에게 감사를 표한다. 수집 및 환자 자료의 사용은 대학 뒤스부르크 - 에센의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (14-6028-BO).

이 프로토콜은 뒤스부르크 - 에센 대학의 의료 학부의 윤리위원회에 의해 승인 된 인간의 연구의 지침을 따릅니다 (14-6028-BO).
1. 혈액 또는 소변 샘플 수집 및 폴리오마 바이러스 DNA의 격리
<ol><li>EDTA 관 또는 수집 관에 있는 소변에 있는 혈액의 적어도 3 mL를 수집합니다.</li>
	<li>샘플을 2,500 x g에서 15 분 동안 원심 분리합니다. 필요한 경우, 파이펫 플라즈마를 새로운 튜?...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

이 문서에서는, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR) 구동 초기 및 후기 프로모터 활성의 분석을 허용하는 일반적으로 사용되는 방법이 제시된다. NCCR 활성은 동시에 측정될 수 있으며 형질감염된 세포의 라시스가 필요하지 않습니다. 더욱이, 비교적 많은 수의 세포를 분석할 수 있으며 형광 값의 정상화를 위한 추가 마커의 병용형화가 필요하지 않다.
이 방법의 중요한 부분은 복제된 N...

폴리오마바이러스는 시미미안 바이러스 40(SV40)을 시제품 종으로 가진 작은 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스의 독립적인 군을 나타낸다. 1 차적인 감염은 일반적으로 질병 현상 없이 진행하고 일반적으로 면역 유능한 호스트에 있는 잠복 감염을 일으키는 원인이 되는 유년기 도중 주로 생깁니다. BK-폴리오마바이러스 (BKPyV)는 주로 신장 관 세포에서 신병요법을 일으키지 않고 지속하지만, 신장 이식 후 면역 능력이 손상된 경우 바이러스가 재활성화되어 심각한 손상및 이식 이식 장애를 일으킬 수 있습니다. 높은 비혈증에 도달할 때 기능 (1 x 104 BKPyV DNA 사본 / mL) 1,2. 신장 이식 수혜자의 대략 10%에서, BK-polyomavirus (BKPyV)의 재활성화는 신장 동종 이식 실패의 고위험과 관련되었던 80%까지 관련되었던 polyomavirus 관련되는 신장 병증 (PyVAN)귀착됩니다3,4 . 승인된 항바이러스제를 사용할 수 없기 때문에 현재 치료법은 면역 억제의 감소에 기초합니다. 흥미롭게도, mTOR 억제제는 항 바이러스 효과가있는 것 같다; 따라서, 면역억제 요법을 mTOR 계 면역억제로 전환하면 BKPyV 비레미아 5,6,7의 진행을 방지하는 대안적 접근법을 나타낼 수 있다. 그러나, mTOR 계 항바이러스 메커니즘은 현재 아직 불완전하게 이해된다. 따라서, 임상적으로 관련된 농도에서 잠재적항바이러스제의 영향을 측정하는 방법이 요구된다.
BKPyV의 원형 게놈은 약 5kb의 비코딩 제어 영역(NCCR)을 품고 복제의 기원역할을 하며, 이와 일치하게 초기 및 후기 단계 mRNA 전사체의 발현을 유도하는 양방향 프로모터로 구성된다. NCCR-재배열, 결실 및 중복이 병원성 BKPyV 8에서 발견되기 때문에 PVAN5,9,전형(wt)의 비교를 통해 유의하게 축적된 환자들로부터 재배열 (rr) NCCR 활동은 바이러스 복제 피트니스를 특성화하는 데 도움이됩니다.
도1에 요약된 바와 같이, 이 프로토콜은 기자 플라스미드 5로부터 발현된 두 개의 형광단 tdTomato 및 eGFP의 형광을 정량화함으로써 BKPyV NCCR 전사 활성을 측정하는 일반적인 방법을설명한다. 9,10,11. 절차는 SV40 대형 T 항원(lTAg)의 존재에서 수행되며, 이는 NCCR 활성 초기에 및 후기에 대한 잠재적항바이러스제의 영향을 별도로 분석할 수 있다5. 이 분석은 NCCR 활성에 대한 재배열의 영향을 추가로 분석하고 wt-NCCrRs5,9. 리포터 플라스미드는 각각 tdTomato 및 eGFP에 대한 두 전사체의 비교가능한 효율적인 처리를 보장하기 위해 각 형광부 개방 판독 프레임의 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 하류를 항구합니다. qRT-PCR 기반 방법5,12에비해, 이 FACS 기반 접근법은 감염된 세포 배양에 대한 복잡한 추출 프로토콜이 없고 비용이 많이 들지 않으므로 저렴한 비용과 높은 처리량 호환 대안을 나타냅니다. 면역 형광 염색을 위한 항체가 필요합니다. 더욱이, 정의된 양의 형광세포가 유세포분석을 통해 분석되기 때문에, 세포주기 억제제의 분석도 정량적 방식으로 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

BK-폴리오마바이러스(BKPyV)와 같은 폴리오마바이러스는 면역 손상 환자에서 심각한 병리학을 유발할 수 있습니다. 그러나, 매우 효과적인 항 바이러스는 현재 사용할 수 없기 때문에, 잠재적인 항 바이러스 에이전트의 영향을 측정 하는 방법이 필요. 여기서, BKPyV 비코딩 제어 영역(NCCR)의 분석을 가능한 이중 형광 리포터는 tdTomato 및 eGFP를 통해 바이러스 유전자 발현에 대한 잠재적항바이러스 약물의 영향을 정량화하기 위해 구축되었다. 식. 또한, 본 프로토콜에서 면역손상신장 이식 환자의 혈액 유래 DNA로부터 예시적으로 수득된 BKPyV-NCCR 앰플리칸을 복제함으로써, NCCR 재배열이 바이러스 성 유전자 발현에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 환자 유래 앰플리톤의 클로닝에 이어, HEK293T 세포를 리포터 플라스미드로 형질전환시키고, 잠재적인 항바이러스제로 치료하였다. 이어서, 세포는 평균 형광 강도 72시간 후 형질감염을 측정하기 위한 FACS 분석을 실시하였다. 또한 잠재적인 세포 주기 억제 효과가 있는 약물의 분석을 테스트하기 위해 형질감염 및 따라서 형광 세포만 사용됩니다. 이러한 분석이 큰 T 항원 발현 세포에서 수행되기 때문에, 조기 및 후기 발현의 영향은 상호 독립적인 방식으로 분석될 수 있다.

본 대표적인 실험에서, BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성은 유세포측정을 통해 측정하였다. 또한, BKPyV 재활성화 후 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 mTOR 억제제는 바이러스 성 초기 유전자 발현의 억제를 위해 시험되었다. 이를 위해, 이중 형광-리포터 분석이 이전에 출판된바와 같이 사용되었다 5. 실험 설정의 전체 워크플로 우표 ...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

유세포측정을 통한 BK-폴리오마바이러스 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성 측정

이 원고에서, 프로토콜은 tdTomato 및 eGFP를 발현하는 양방향 리포터 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포를 이용하여 BK-폴리오마바이러스 전사 활성의 FACS 기반 측정을 수행하기 위해 제시된다. 이 방법은 바이러스 전사에 대한 신규 화합물의 영향을 정량적으로 결정할 수 있게 한다.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 유동 세포형을 통해 이중 형광 세포를 측정하여 BK-polyomavirus 비코딩 제어 영역 구동 전사 활성을 측정하는 것입니다. BK-polyomavirus는 면역 손상한 환자에 있는 가혹한 병리를 일으키는 원인이 될 수 있습니다, 특히 신장 이식 수신자에서. 그러나, 매우 효과적인 바이러스 백신은 현재 사용할 수 없기 때문에, 다른 화합물의 잠재적인 항 바이러스 영향을 측정 하는 방법이 필요.이 방법을 통해 바이러스 학자들은 비코딩 제어 영역에 의해 구동되는 BK-polyomavirus 전사 활동에 영향을 미치는 잠재적 인 항 바이러스 제의 영향을 분석 할 수 있습니다. 이 분석법은 또한 전형적인 비코딩 제어 영역에 비해 프로모터 활동에 대한 재배열의 영향을 연구할 수 있게 한다. 이중 형광 보고서와 함께 바이러스 프로모터 활성을 연구하는 장점은 조기 및 후기 유전자 발현을 상호 독립적으로 분석할 수 있다는 점입니다.더욱이, 바이러스증및 장기전성세포 배양실험의 어려운 천공은 전염및 형광세포만 분석되기 때문에 필요하지 않으며, 세포 생존력과 천공을 감소시키는 약물도 연구할 수 있다. 이 프로토콜은 뒤스부르크 에센 대학의 의학 교수의 윤리위원회에 의해 승인된 인간 연구의 지침을 따릅니다. 첫 번째 단계는 다종 바이러스 DNA의 격리를 위한 혈액 샘플을 수집하는 것입니다.EDTA 획득 튜브에서 적어도 3 밀리리터의 혈액을 수집합니다. 샘플을 2, 500 G에서 15분 동안 원심분리하고 플라즈마를 새로운 튜브로 피펫합니다. 단백질 SK 40마이크로리터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 준비하고 파이펫팅을 통해 400마이크로리터 플라즈마를 추가합니다.제조업체의 지침에 설명된 대로 DNA 얼룩 추출 키트를 사용하여 DNA를 분리합니다. 프라이머 쌍 A를 사용하여 사전 PCR에 대한 마스터 믹스를 총 50 마이크로리터로 준비하고 이전에 격리된 DNA를 사용합니다. 마스터 믹스의 45 마이크로리터를 PCR 튜브에 분배합니다.PCR 튜브에 격리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 추가하고 표 3에 도시 된 바와 같이 반응 조건으로 PCR을 실행합니다. 35사이클에서 반복 적인 변성 어닐링 및 확장을 반복합니다. 중첩 된 응용 프로그램의 경우 복제에 대한 제한 사이트를 수용 하는 프라이머 쌍 B를 사용합니다.PCR 제품의 마이크로리터 10개를 6배 젤 로딩 염료 2개의 마이크로리터와 혼합합니다. 1.5% 아가로즈 젤에 믹스 10 마이크로리터를 적재하고 60 밀리암페어에서 30분 동안 젤을 실행합니다. 적절한 UV 문서화 시스템을 사용하여 젤을 시각화합니다.제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 앰플리턴을 정화합니다. 섭씨 37도에서 2시간 동안 지표 제한 효소로 정제된 앰플리턴을 소화합니다. 소화된 앰플리턴을 정화하기 위해 정화 단계를 반복합니다.동시에 플라스미드 백본을 소화합니다. 소화된 플라스미드 백본을 0.8% 낮은 마운트 아가로즈 젤로 분석합니다. 40 밀리암페어보다 높은 전류에서 젤을 실행하지 마십시오.긴 파도 UV 빛을 사용하여 DNA 조각을 시각화하고 깨끗한 메스를 사용하여 구부러진 백본을 잘라냅니다. DNA 손상을 방지하기 위해 긴 UV 노출 시간을 피하십시오. 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브로 플로멜 젤 조각 조각에 대한 울타리.낮은 모드 아가로즈 조각을 함유한 백본을 섭씨 65도에서 10분간 가열하여 젤 조각을 녹이고 2분마다 부드러운 소용돌이로 섞습니다. 용융 젤은 결찰에 직접 사용할 수 있습니다. Ligate 백본과 T4 DNA 리개아제를 사용하여 소화된 앰플리코가 섭씨 16도에서 하룻밤 을 지니게 합니다.표준 복제 절차 후 플라즈마 DNA를 분리합니다. 제한 효소 소화를 수행하여 양성 클론을 확인하고 1% 아가로즈 젤에서 소화된 조각을 시각화합니다. 종자 100, 000 HEK293T 세포는 12웰 플레이트 의 웰 당 24시간 전 과배및 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하고, 형질 전환 시 활성 증식을 유지한다.세포는 경질에서 대략 80%의 합류에 있어야 합니다. 멸균 튜브에 감소 된 혈청 매체250 마이크로 리터를 넣고 보고된 각 플라즈마 DNA의 마이크로그램을 추가하고 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. DNA 혼합물에 3개의 마이크로리터를 추가하고 피펫팅하여 부드럽게 섞어 섭씨 22도에서 15분 동안 배양합니다.혼합물을 넣고 우물에 드롭와이즈를 넣고 웰에 부드럽게 분배합니다. 4시간 후, 상체를 테스트 에이전트 및 용매 제어를 포함하는 신선한 매체로 교체하십시오. 이 예에서, mTOR 억제제 INK-128 및 라파마이신이 사용되었다.분석전까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 형광 현미경의 밑에 적색과 녹색 형광을 위한 세포를 검사합니다. 적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응한다.72 시간 후 트랜스포션, 신중하게 상체를 갈망. 차가운 PBS의 1 밀리리터로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 부드럽게 500 마이크로 리터 트립신을 추가하고 세포의 조기 분리를 피하기 위해 약간 접시를 켭니다.이 단계는 셀 더블을 방지하는 것이 중요합니다. 또한 트립신은 동일한 파이펫 팁으로 직접 제거됩니다. 섭씨 37도에서 적어도 5분 동안 세포를 배양한다.트립신 S 세포를 3%FCS를 함유한 1밀리리터 PBS로 다시 중단하고 사전 표지된 FACS 튜브에서 서스펜션을 전송합니다. FACS 분석 전에 밀리리터당 1마이크로그램의 농도에 DAPI를 추가합니다. 유동 세포계를 사용하여 세포를 분석합니다.각 샘플에 대해, 적어도 10, 000 살아있는 세포를 측정합니다. 정확한 결과를 얻기 위해서는 빨간색 및 녹색 신호를 구별하는 데 초기 보상이 필수적입니다. 비코딩 제어 리젠트는 복제에 대한 제한 부위를 수용하는 내부 프라이머 쌍을 사용하여 중첩된 PCR 프로토콜을 사용하여 증폭되었다.앰플리콘 검증은 아가로즈 겔 전기전도를 통해 수행되었지만 겔내 균질 크기 분포에서 전형적인 NCCR 서열에서 유래된 앰플리콘은 삽입 및 삭제를 가진 재배열된 NCC에서 유래한 앰플리콘이 크기가 달랐다. NCCR을 포함하는 양수 클론의 선택은 제한 분석에 의해 확인되었다. 작은 스페이서 영역은 양수 클론을 나타내는 더 큰 NCCR 조각으로 대체되었습니다.검증된 클론으로부터 분리된 플라스미드 DNA가 피로세퀀싱을 위해 보내졌다. 이 예에서는, P 블록내의 삭제 및 O-블록의 대체가 검출되었다. HEK293T 세포는 보고 가능한 구조에 대한 존중으로 과도하게 전염되었고 NCCR 활성은 형광 현미경 검사법에 의해 모니터링되었다.적색 및 녹색 형광은 각각 초기 및 후기 BK-폴리오메 바이러스 유전자 발현에 대응했다. 제1 NCCR은 강한 후기 유전자 발현을 보였고 두 번째 예는 비교적 강하지만 중간 정도의 후기 유전자 발현을 보였다. DAPI 네거티브 셀이 게이트되고 tdTomato 대 eGFP를 보여주는 점 플롯이 만들어졌습니다.tdTomato 또는 eGFP에 대한 긍정적뿐만 아니라 부정적인 샘플은 분석에만 포함되었습니다. 평균 형광 강도는 각 테스트 클론에서 파생되었다. 이 예에서, 이중 mTOR 억제제 INK128을 통한 치료는 tdTomato MFI를 현저히 감소시켰으며 이는 조기 발현이 억제되었다는 것을 의미한다.이 방법을 사용하면 전사 활성을 통해 BK-polyomavirus를 검출하기 위해 현재 사용되고 있는 다른 화합물을 식별할 수 있습니다. 초기 유전자 발현에서, 이것은 확실히 바이러스성 연루를 결정합니다. 억제 방울은 BK-polyomavirus 재활성화의 경우 면역 손상된 환자를 위한 에이전트로서 사용되는 것으로 간주될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

연구

유전학

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

셀 기반 비 코딩 RNAs 특히 mRNA 번역을 향상 시킬 수 있는 SINEUP의 분석 실험

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

인공 RNA 폴리머라제 II 연신복합체 해부 공동 전사 RNA 처리 이벤트

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...