Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatterne takker Barbara Bleekmann for utmerket teknisk assistanse. Disse studiene ble støttet av IFORES-programmet ved Universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet ved University Alliance Ruhr and Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for doktorgrads fellesskap av Helene Sertznig og konstant støtte. Innsamling og bruk av pasient materiale har blitt godkjent av etikk komité for medisinsk fakultet ved Universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Denne protokollen følger retningslinjene for menneskelig forskning som godkjent av ethic Committee av medisinsk fakultet ved Universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. innsamling av blod-eller urinprøver og isolering av polyomavirus DNA
<ol><li>Samle minst 3 mL blod i EDTA-rør eller urin i oppkjøpet rør.</li>
	<li>Sentrifuger prøven ved 2 500 x g i 15 min. Hvis nødvendig, pipette plasma inn i et nytt rør og oppbevar plasma prøvene ved 4 ° c i flere dager eller fryse v...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

I denne artikkelen presenteres en ofte brukt metode som gjør det mulig for analyse av BKPyV ikke-koding kontroll-region (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet. Den NCCR aktivitet kan måles samtidig og trenger ikke lyse av transfekterte celler. Videre kan et relativt stort antall celler bli analysert og co-transfeksjoner av ekstra markører for normalisering av de fluorescens verdiene er ikke nødvendig.
En kritisk del av denne metoden er at klonet NCCR skal inneholde nøyaktig de sa...

Polyomaviruses representerer en uavhengig familie av små dobbel-strandet DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototype arter. Den primære infeksjonen oppstår hovedsakelig i løpet av barndommen, som vanligvis går uten sykdomssymptomer og vanligvis forårsake latente infeksjoner i uimottakelig kompetente verter. Den BK-polyomavirus (BKPyV) hovedsakelig vedvarer i renal tubuli celler uten å forårsake nephropathologies, men i tilfelle av svekkelse av immun-kompetanse etter nyre transplantasjon viruset kan reaktivere og forårsake alvorlige skader og nedsatt pode funksjon når man når en høy viremia (1 x 104 BKPyV DNA eksemplarer/ml)1,2. I ca 10% av nyre transplantasjon mottakere, reaktivering av BK-polyomavirus (BKPyV) resulterer i en polyomavirus assosiert nefropati (PyVAN), som var opp til 80% assosiert med en høy risiko for nyres allograft svikt3,4 . Siden ingen godkjente antivirale midler er tilgjengelig, er aktuell behandling basert på reduksjon av immunsuppresjon. Interessant, mTOR hemmere synes å ha en antiviral effekt; Dermed kan det å bytte immunsuppressiv-behandlingen til mTOR-baserte immunsuppresjon representere en alternativ tilnærming for å hindre progresjon av BKPyV viremia5,6,7. Imidlertid, det mTOR-basert antiviral mekanikk er aktuelle fremdeles ufullstendig forstod. Dermed kreves metoder som måler virkningen av potensielle antivirale midler i klinisk relevante konsentrasjoner.
Den sirkulære Genova av BKPyV består av ca 5 kb harboring en ikke-koding kontroll region (NCCR) som fungerer som en opprinnelse av replikering og samtidig en toveis promoter kjører uttrykk for tidlig og sent fase mRNA transkripsjoner. Siden spontant forekommende NCCR-rearrangements, slettinger og duplikasjoner finnes i patogene BKPyV8 og signifikant akkumulert hos pasienter som lider av PVAN5,9, en sammenligning av arketypiske (WT) og re-arrangert (RR) NCCR-aktiviteter er nyttig å karakterisere viral replicative fitness.
Som oppsummert i figur 1, beskriver denne protokollen en vanlig brukt metode for å måle BKPyV NCCR transcriptional aktivitet ved kvantifisere fluorescens av to fluorophores TdTomato og eGFP uttrykt fra en reporter plasmider5, 9,10,11. Prosedyren utføres i nærvær av SV40 store T antigen (lTAg), som gjør det mulig å analysere virkningen av potensielle antivirale midler på tidlig og sent NCCR-aktivitet separat5. Denne analysen analyserer videre virkningen av rearrangements på NCCR aktivitet og sammenligning med WT-NCCRs5,9. Reporteren plasmider havner i SV40 sent polyadenylation signal nedstrøms for hver fluoroforen åpne lese ramme for å sikre sammenlignbare og effektiv behandling av både transkripsjoner for tdTomato og eGFP, henholdsvis. Sammenlignet med qRT-PCR baserte metoder5,12, denne FACS-basert tilnærming representerer en lav kostnad og høy gjennomstrømming kompatibelt alternativ siden ingen kompliserte utvinning protokoller for infiserte cellekultur og ingen dyre antistoffer for immun fluorescens farging er nødvendig. Videre, siden en definert mengde fluorescerende celler er analysert via Flow flowcytometri, analyse av celle syklus hemme agenter er også mulig i en kvantitativ måte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Polyomaviruses, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan forårsake alvorlige sykdommer hos immunsupprimerte pasienter. Men, siden svært effektive antivirale midler er for øyeblikket ikke tilgjengelig, metoder måle effekten av potensielle antivirale midler er nødvendig. Her, en dual fluorescens reporter som gjør at analysen av BKPyV ikke-koding kontroll-regionen (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet ble konstruert for å kvantifisere effekten av potensielle antivirale legemidler på viral genuttrykk via tdTomato og eGFP Uttrykk. I tillegg, ved kloning BKPyV-NCCR amplicons som i denne protokollen har blitt eksempelvis innhentet fra blod-avledet DNA av immunsupprimerte nyretransplanterte pasienter, kan virkningen av NCCR-rearrangements på viral genuttrykk bestemmes. Etter kloning av pasienten avledet amplicons, HEK293T celler ble transfekterte med reporter-plasmider, og behandlet med potensielle antivirale midler. Deretter ble celler utsatt for FACS-analyse for måling bety fluorescens intensitet 72 h post transfeksjoner. Å også teste analyse av legemidler som har en potensiell celle syklus hemmende effekt, bare transfekterte og dermed fluorescerende celler brukes. Siden denne analysen er utført i store T antigen uttrykke celler, kan virkningen av tidlig og sent uttrykk analyseres på en gjensidig uavhengig måte.

I dette representative eksperimentet ble BK-polyomavirus non-Coding Control region drevet transcriptional aktivitet målt via strømnings flowcytometri. I tillegg, en mTOR inhibitor, som kan brukes til å behandle pasienter etter BKPyV reaktivering, ble testet for sin hemming av viral tidlig genuttrykk. For å gjøre dette, en dual fluorescens-reporter analysen ble brukt som publisert tidligere5. Det generelle arbeidsflytoppsettet for det eksperimentelle oppsettet ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Måling av BK-polyomavirus ikke-Coding Control region drevet Transcriptional aktivitet via Flow flowcytometri

I dette manuskriptet presenteres en protokoll for å utføre FACS-basert måling av BK-polyomavirus transcriptional aktivitet ved å bruke HEK293T celler transfekterte med en toveis reporter plasmider som uttrykker tdTomato og eGFP. Denne metoden videre gjør det mulig å kvantitativt bestemme innflytelsen av romanen forbindelser på viral transkripsjon.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å måle BK-polyomavirus ikke-koding kontroll region drevet transkripsjonsaktivitet ved å måle to fluorescerende celler via flytcytometri. BK-polyomaviruset kan forårsake alvorlige patologier hos immunkompromitterte pasienter, spesielt hos nyretransplanterte mottakere. Men siden svært effektiv antivirus for øyeblikket ikke er tilgjengelige, er metoder som måler den potensielle anti-virale virkningen av andre forbindelser nødvendig.Denne metoden gjør det mulig for virologer å analysere virkningen av potensielle anti-virale midler som påvirker BK-polyomavirustranskripsjonell aktivitet drevet av ikke-kodingskontrollområdet. Denne analysen gjør det mulig å studere påvirkningen av omorganiseringer på arrangøraktiviteten i forhold til arketypiske ikke-kodingskontrollområder. Fordelen med å studere den virale promoteraktiviteten med en dobbel fluorescensrapport er at tidlig og sent genuttrykk kan analyseres på en gjensidig uavhengig måte.Videre er den vanskelige perforeringen av viruslagre og langsiktige smittsomme cellekultureksperimenter ikke nødvendig siden bare trans infiserte og fluorescerende celler analyseres, også stoffer som reduserer celle levedyktigheten og perforeringen kan studeres. Denne protokollen følger retningslinjene for menneskelig forskning som godkjent av etikkkomiteen til det medisinske fakultetet ved Universitetet i Duisburg-Essen. Det første trinnet er å samle blodprøver for isolering av polyomavirus DNA.Samle minst tre milliliter blod i EDTA oppkjøpsrør. Sentrifuger prøven ved 2, 500 G i 15 minutter og pipette plasmaet til et nytt rør. Forbered 40 mikroliter protein SK i et 1,5 milliliter mikrosentrigerrør og tilsett 400 mikroliter plasma ved pipettering.Isoler DNA ved hjelp av et DNA-blotekstraksjonssett som beskrevet i produsentens instruksjoner. Forbered hovedblandingen for pre-PCR ved hjelp av primerpar A i et totalt volum på 50 mikroliter og bruk det tidligere isolerte DNA-et. Fordel 45 mikroliter av masterblandingen i PCR-rørene.Legg til fem mikroliter av det isolerte DNA-et i PCR-rørene og kjør PCR med reaksjonsforholdene som vist i tabell tre. Gjenta denaturation annealing og forlengelse i 35 sykluser. For nestet program, bruk primer par B, som skjuler restriksjonsstedene for kloning.Bland 10 mikroliter av PCR-produktet med to mikroliter på seks ganger gellastende fargestoff. Legg 10 mikroliter av blandingen på en 1,5% agarose gel og kjør gelen i 30 minutter ved 60 milliampere. Visualiser gelen ved hjelp av et passende UV-dokumentasjonssystem.Rens PCR-forlikene ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner. Fordøy de rensede ampliklonene med indikatorbegrensningsenzymene i to timer ved 37 grader Celsius. Gjenta rensetrinnene for å rense de fordøyde ampliklonene.Parallelt fordøyer også plasmid ryggraden. Analyser den fordøyde plasmid ryggraden på en 0,8% lav mount agarose gel. Ikke kjør gelen med en høyere strøm enn 40 milliampere.Visualiser DNA-fragmenter ved hjelp av langbølge UV-lys og kutt ut ryggraden bøyd ved hjelp av en ren skalpell. Unngå lange UV-eksponeringstider for å forhindre DNA-skade. Gjerde for stykke flomel gel fragment inn i en ny 1,5 milliliter mikro-sentrifuge rør.Varm ryggraden som inneholder lav modus agarose stykke i 10 minutter ved 65 grader Celsius for å smelte gelstykket og bland hvert andre minutt ved mild vortexing. Den smeltede gelen kan brukes direkte til ligation. Ligate ryggrad og fordøyd amplicon ved hjelp av T4 DNA ligase over natten på 16 grader Celsius.Etter standard kloning prosedyre, isolere plasma DNA. Utfør begrensning enzymfordøyelse for å se etter positive kloner og visualisere fordøyde fragmenter på en 1% agarose gel. Seed 100, 000 HEK293T celler per brønn av 12 brønnplate 24 timer før transfection og inkubere over natten ved 37 grader Celsius, opprettholde aktiv spredning under transinfeksjon.Celler bør være omtrent ved 80% samløpet ved transinfeksjon. Plasser 250 mikroliter med reduserte serummedier i sterilt rør og tilsett ett mikrogram av hvert rapporterte plasma-DNA og bland forsiktig ved pipettering. Tilsett tre mikroliter av transfeksjonsreagensen til DNA-blandingen og bland forsiktig ved å pipettering og inkubere i 15 minutter ved 22 grader Celsius.Tilsett blandingen, drop-wise til brønnen og forsiktig distribuere til brønnen. Etter fire timer erstatter du supernatanten med friskt medium som inneholder testagentene og løsningsmiddelkontrollen. I dette eksemplet ble mTOR-hemmere INK-128 og rapamycin brukt.Inkuber ved 37 grader Celsius til analyse. Kontroller celler for rød og grønn fluorescens under fluorescensmikroskopet. Rød og grønn fluorescens tilsvarer henholdsvis det tidlige og sene BK-polyomavirusgenuttrykket.72 timer etter transfection, nøye strebe etter supernatant. Vask cellene to ganger med en milliliter kald PBS. Tilsett forsiktig 500 mikroliter trypsin og vri platen litt for å unngå for tidlig løsrivelse av cellene.Dette trinnet er viktig for å unngå celledobbelter. Etter tillegg fjernes trypsin direkte med samme pipettespiss. Inkuber cellene i minst fem minutter ved 37 grader Celsius.Re-suspend trypsin S celler med en milliliter PBS inneholder 3% FCS og overføre suspensjon i forhåndsmerkede FACS rør. Tilsett DAPI med en konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter før FACS-analyse. Analyser cellene ved hjelp av et strømningssytometer.For hvert utvalg måler du minst 10 000 levende celler. Innledende kompensasjon er avgjørende for å skille mellom røde og grønne signaler for å oppnå nøyaktige resultater. Ikke-koding kontroll regent ble forsterket ved hjelp av en nestet PCR-protokoll ved hjelp av den indre primer par som huser restriksjonen nettsteder for kloning.Amplicon verifisering ble utført via agarose gel elektroforese Mens amplicons avledet fra arketypiske NCCR sekvenser ved en homogen størrelse distribusjon i gelen, de avledet fra omorganiserte NCCRs med innsettinger og slettinger, forskjellig i deres størrelse. Valg av positive kloner som inneholder NCCR ble verifisert ved begrensningsanalyse. Den lille avstandsregionen ble erstattet av de større NCCR-fragmentene som indikerer positive kloner.Plasmid DNA isolert fra verifiserte kloner ble sendt for pyrosequencing. I dette eksemplet ble slettingen i P-blokken og erstatningen i O-blokken oppdaget. HEK293T-celler ble forbigående infisert med respekt for rapporterbar konstruksjon og NCCR-aktivitet ble overvåket av en fluorescensmikroskopi.Røde og grønne fluorescerende tilsvarte henholdsvis tidlig og sent BK-polyomavirusgenuttrykk. Den første NCCR viste et sterkt sent genuttrykk, mens det andre eksemplet hadde et relativt sterkt tidlig, men moderat sent genuttrykk. DAPI negative celler ble inngjerdet og en prikk plot ble opprettet som viser eGFP versus tdTomato.Prøver som var negative så vel som de positive for tdTomato eller eGFP ble bare inkludert i analysen. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet ble avledet fra hver testklone. I dette eksemplet reduserte behandlingen med den doble mTOR-hemmeren INK128 signifikant tdTomato MFI, noe som betyr at tidlig uttrykk ble hemmet.Denne metoden gjør det mulig å identifisere for tiden brukt og andre forbindelser for å oppdage BK-polyomavirus gjennom transkripsjonsaktivitet. I tidlig genuttrykk bestemmer dette desidert den virale implikasjonen. Hemmende dråper kan betraktes som midler for immunkompromitterte pasienter ved reaktivering av BK-polyomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA rullegardinmenyen prosedyre å identifisere RNA mål av en lenge ikke-koding

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cellen basert analyser av SINEUP ikke-koding RNAs som spesielt kan forbedre mRNA oversettelse

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Bruke Sniper-Cas9 å minimere Off-målet effekter av CRISPR-Cas9 uten tap av på målet aktivitet Via regissert evolusjon

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...