Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Os autores agradecem a Barbara Bleekmann pela excelente assistência técnica. Estes estudos foram apoiados pelo IFORES-programa da Universidade de Duisburg-Essen Medical School e do RIMUR-programa da Universidade Alliance Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Os autores agradecem a Jürgen-Manchot-Stiftung pela bolsa de doutorado de Helene Sertznig e apoio constante. A coleta e uso do material do paciente foi aprovada pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana, conforme aprovado pelo Comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. coleta de amostras de sangue ou urina e isolamento de DNA de poliomavirus
<ol><li>Colete pelo menos 3 mL de sangue em tubos de EDTA ou urina em tubos de aquisição.</li>
	<li>Centrifugue a amostra a 2.500 x g durante 15 min. Se necessário, pipeta o plasma em um tubo novo e armazene as amostras do plasma em 4 ° ...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

Neste artigo, um método comumente usado é apresentado que permite a análise do BKPyV não-codificação controle-região (NCCR) impulsionado atividade promotor precoce e tardia. A atividade da NCCR pode ser medida simultaneamente e não precisa de Lise das células transfectadas. Além disso, um número relativamente grande de pilhas pode ser analisado e o co-transfection de marcadores adicionais para a normalização dos valores da fluorescência não é necessário.
Uma parte crítica des...

Os poliomavírus representam uma família independente de pequenos vírus de DNA duplo-encalhado (dsDNA) com o vírus Simian 40 (SV40) como uma espécie de protótipo. A infecção primária ocorre principalmente durante a infância, que geralmente prosseguem sem sintomas de doença e geralmente causam infecções latentes em hospedeiros competentes imunológicos. O BK-Polyomavirus (BKPyV) persiste principalmente em células tubulares renais sem causar nefropatologia, no entanto, em caso de comprometimento da imuno-competência após o transplante renal, o vírus pode reativar e causar danos graves e comprometimento do enxerto função ao atingir uma viremia alta (1 x 104 bkpyv DNA cópias/ml)1,2. Em aproximadamente 10% dos receptores de transplante renal, a reativação do BK-Polyomavirus (bkpyv) resulta em uma nefropatia associada ao poliomavírus (pyvan), que foi de até 80% associada a um alto risco de falhas renais do aloenxerto3,4 . Desde que nenhum agente antiviral aprovado está disponível, a terapia atual é baseada na redução do immunosuppression. Curiosamente, os inibidores de mTOR parecem ter um efeito antiviral; assim, comutar a terapia imunossupressores ao imunossupressão mTOR-baseado pôde representar uma aproximação alternativa para impedir a progressão do bkpyv viremia5,6,7. No entanto, o mecanismo antiviral baseado em mTOR é atualmente ainda incompletamente compreendido. Assim, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais em concentrações clinicamente relevantes.
O genoma circular do BKPyV consiste em aproximadamente 5 KB abrigando uma região de controle não-codificante (NCCR) que serve como uma origem de replicação e concomitantemente um promotor bidirecional dirigindo a expressão de transcrições de mRNA de fase precoce e tardia. Desde que ocorra espontâneamente nccr-rearranjos, deleções, e duplicações são encontrados no bkpyv patogénico8 e acumulado significativamente nos pacientes que sofrem de pvan5,9, uma comparação de arquetípico (WT) e Re-arranjado (RR) NCCR-atividades são úteis para caracterizar a aptidão replicativa viral.
Como resumido na Figura 1, este protocolo descreve um método comumente usado para medir a atividade transcricional de BKPyV nccr quantificando a fluorescência de dois fluoróforos tdTomato e EGFP expressos a partir de um repórter plasmídeo5, 9,10,11. O procedimento é realizado na presença do antígeno T SV40 grande (lTAg), que permite analisar o impacto de potenciais agentes antivirais na atividade de NCCR precoce e tardia separadamente5. Este ensaio analisa ainda mais o impacto dos rearranjos sobre a atividade da nccr e a comparação com o WT-nccrs5,9. O plasmídeo do repórter abriga o sinal atrasado da poliadenilação SV40 a jusante de cada frame de leitura aberto do fluoróforo para assegurar o processamento comparável e eficiente de ambos os transcritos para tdtomato e EGFP, respectivamente. Comparado aos métodos baseados em qRT-PCR5,12, esta aproximação FACS-baseada representa uma alternativa compatível do baixo custo e da taxa de transferência elevada desde nenhuns protocolos complicados da extração para a cultura de pilha contaminada e nenhum caro os anticorpos para a mancha imune da fluorescência são necessários. Além disso, uma vez que uma quantidade definida de células fluorescentes é analisada através da citometria de fluxo, a análise dos agentes inibidores do ciclo celular também é possível de forma quantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Os poliomavírus, como o BK-Polyomavirus (BKPyV), podem causar patologias severas em pacientes imunocomprometidos. No entanto, uma vez que os antivirais altamente eficazes não estão atualmente disponíveis, são necessários métodos que medem o impacto de potenciais agentes antivirais. Aqui, um repórter de fluorescência dupla que permite a análise do BKPyV não-codificação de controle-região (NCCR) impulsionado atividade precoce e tardia promotor foi construído para quantificar o impacto de potenciais medicamentos antivirais na expressão gênica viral via tdTomato e eGFP Expressão. Além, clonando os amplicões de bkpyv-nccr que neste protocolo foram obtidos exemplarmente do ADN sangue-derivado de pacientes transplantados renais imunocomprometidos, o impacto de nccr-rearranjos na expressão de gene viral pode ser determinado. Depois da clonagem dos amplicons derivados pacientes, as pilhas HEK293T foram transfected com o repórter-Plasmids, e tratadas com os agentes antivirais potenciais. Subseqüentemente, as pilhas foram sujeitadas a FACS-análise para medir as intensidades médias da fluorescência 72 h transfection do borne. Para testar também a análise de drogas que têm um potencial efeito inibidor do ciclo celular, apenas transfected e, portanto, as células fluorescentes são usadas. Desde que este ensaio é executado no grande antígeno de T que expressa pilhas, o impacto da expressão adiantada e atrasada pode ser analisado em uma maneira mutuamente independente.

Neste experimento representativo, a atividade transcricional da região de controle não-codificante BK-Polyomavirus foi mensurada via citometria de fluxo. Além, um inibidor de mTOR, que possa ser usado para tratar pacientes após o reactivation de BKPyV, foi testado para sua inibição da expressão adiantada viral do gene. Para tal, utilizou-se um ensaio de dupla fluorescência-repórter como publicado anteriormente5. O esquema de fluxo de trabalho geral da conf...

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Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Medição de BK-Polyomavirus não-codificação região controle driven transcriptional atividade via citometria de fluxo

Neste manuscrito, um protocolo é apresentado para executar a medida FACS-baseada da atividade transcricional de BK-Polyomavirus usando as pilhas HEK293T transfected com um plasmídeo bidirecional do repórter que expressa tdtomato e EGFP. Este método permite determinar quantitativamente a influência de novos compostos na transcrição viral.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

O objetivo geral deste protocolo é medir a atividade transcricional baseada na região de controle de não codificação BK-polyomavirus, medindo células fluorescentes duplas através da citometria de fluxo. O BK-poliomavírus pode causar patologias graves em pacientes imunocomprometidos, especialmente em receptores de transplante renal. No entanto, como o antivírus altamente eficaz não está disponível no momento, são necessários métodos que medem o potencial impacto antiviral de outros compostos.Este método permite que os virologistas analisem o impacto de potenciais agentes antivirais que afetam a atividade transcricional BK-poliomavírus impulsionada pela região de controle de não codificação. Este ensaio permite ainda estudar a influência dos rearranjos na atividade do promotor em comparação com regiões arquetípicas de controle não codificação. A vantagem de estudar a atividade de promotor viral com um relatório de fluorescência dupla é que a expressão genética precoce e tardia pode ser analisada de forma mutuamente independente.Além disso, a difícil perfuração de estoques de vírus e experimentos de cultura de células infecciosas de longo prazo não são necessárias, uma vez que apenas células transfeinadas e fluorescentes são analisadas, também drogas que reduzem a viabilidade celular e a perfuração podem ser estudadas. Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana aprovadas pelo comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen. O primeiro passo é coletar amostras de sangue para o isolamento do DNA do poliomavírus.Colete pelo menos três mililitros de sangue nos tubos de aquisição da EDTA. Centrifugar a amostra a 2.500 G por 15 minutos e pipeta o plasma em um novo tubo. Prepare 40 microliters de proteína SK em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e adicione 400 microliters plasma por pipetação.Isole o DNA usando um kit de extração de manchas de DNA, conforme descrito nas instruções do fabricante. Prepare a mistura mestre para o pré-PCR usando o par de primer A em um volume total de 50 microliters e use o DNA anteriormente isolado. Distribua 45 microliters da mistura mestre nos tubos PCR.Adicione cinco microliters do DNA isolado nos tubos PCR e execute o PCR com as condições de reação como ilustrado na tabela três. Repita a desnaturação e a extensão em 35 ciclos. Para aplicação aninhada, use o par de primer B, abrigando os locais de restrição para clonagem.Misture 10 microliters do produto PCR com dois microliters de corante de carregamento de gel de seis dobras. Carregue 10 microliters da mistura em um gel de 1,5% de agarose e execute o gel por 30 minutos a 60 miliampere. Visualize o gel usando um sistema de documentação UV apropriado.Purifique os amplicons pcr usando um kit de purificação pcr de acordo com as instruções do fabricante. Digerir os amplicons purificados com as enzimas de restrição de indicadores por duas horas a 37 graus Celsius. Repita as etapas de purificação para purificar os amplicons digeridos.Em paralelo, também digerir a espinha dorsal plasmida. Analise a espinha dorsal plasmida digerida em um gel de 0,8% de montagem baixa. Não execute o gel a uma corrente superior a 40 miliampere.Visualize fragmentos de DNA usando luz UV de ondas longas e corte a espinha dorsal dobrada usando um bisturi limpo. Evite longos tempos de exposição uv para evitar danos ao DNA. Cerca para o pedaço de fragmento de gel flomel em um novo tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro.Aqueça a espinha dorsal contendo peça de agarose de modo baixo por 10 minutos a 65 graus Celsius, a fim de derreter a peça de gel e misturar a cada dois minutos por vórtice suave. O gel derretido pode ser usado diretamente para ligadura. Espinha dorsal ligate e amplicon digerido usando ligase de DNA T4 durante a noite a 16 graus Celsius.Após o procedimento padrão de clonagem, isole o DNA de plasma. Realize a digestão da enzima de restrição para verificar se há clones positivos e visualizar fragmentos digeridos em um gel de 1% de agarose. Semente 100.000 células HEK293T por poço da placa de 12 poços 24 horas antes da transfecção e incubar durante a noite a 37 graus Celsius, manter a proliferação ativa durante a transfecção.As células devem estar aproximadamente em 80% de confluência na transfecção. Coloque 250 microliters de mídia súmada reduzida em tubos estéreis e adicione um micrograma de cada DNA de plasma relatado e misture suavemente por pipetação. Adicione três microliters do reagente de transfecção à mistura de DNA e misture suavemente por pipetação e incubar por 15 minutos a 22 graus Celsius.Adicione a mistura, em termos de gota ao poço e distribua suavemente para o poço. Após quatro horas, substitua o supernascido por um meio fresco contendo os agentes de teste e o controle de solventes. Neste exemplo, foram utilizados os inibidores mTOR INK-128 e rapamicina.Incubar a 37 graus Celsius até a análise. Verifique as células quanto à fluorescência vermelha e verde sob o microscópio de fluorescência. Fluorescência vermelha e verde correspondem à expressão genética BK-polyomavírus precoce e tardia, respectivamente.72 horas após a transfecção, aspira cuidadosamente o supernante. Lave as células duas vezes com um mililitro de PBS frio. Adicione suavemente 500 microliters trypsin e gire a placa ligeiramente para evitar o descolamento prematuro das células.Este passo é importante para evitar dobras celulares. Após a adição, a trippsina é removida diretamente com a mesma ponta de pipeta. Incubar as células por pelo menos cinco minutos a 37 graus Celsius.Re-suspender as células trypsin S com um PBS mililitro contendo 3% DE FCS e transferir a suspensão em tubos FACS pré-rotulados. Adicione DAPI a uma concentração de um micrograma por mililitro antes da análise FACS. Analise as células usando um citômetro de fluxo.Para cada amostra, meça pelo menos 10.000 células vivas. A compensação inicial é essencial para distinguir sinais vermelhos e verdes para alcançar resultados precisos. O regente de controle de não codificação foi amplificado usando um protocolo PCR aninhado usando o par de primer interno que abriga os locais de restrição para clonagem.A verificação de amplicon foi realizada através de eletroforese de gel agarose Enquanto os amplicons derivados de sequências arquetípicas de NCCR em uma distribuição de tamanho homogêneo no gel, aqueles derivados de NCCRs reorganizados com inserções e exclusões, diferem em seu tamanho. A seleção de clones positivos contendo o NCCR foi verificada por análise de restrição. A pequena região espaçadora foi substituída pelos fragmentos maiores do NCCR indicando clones positivos.DNA plasmídeo isolado de clones verificados foram enviados para pyrosequencing. Neste exemplo, foi detectada a exclusão no bloco P e a substituição no bloco O. As células HEK293T foram transitoriamente transfeminadas com o respeito pela construção reportável e a atividade nccr foi monitorada por uma microscopia de fluorescência.Fluorescentes vermelhos e verdes corresponderam à expressão genética BK-polyomavirus precoce e tardia, respectivamente. O primeiro NCCR exibiu uma forte expressão genética tardia, enquanto o segundo exemplo tinha uma expressão genética relativamente forte no início, mas moderada. As células negativas da DAPI foram fechadas e uma parcela de ponto foi criada mostrando eGFP versus tdTomato.Foram incluídas na análise amostras negativas, bem como as positivas para tdTomato ou eGFP. Intensidades médias de fluorescência foram derivadas de cada clone de teste. Neste exemplo, o tratamento com o inibidor dual mTOR INK128 reduziu significativamente o TdTomato MFI, o que significa que a expressão precoce foi inibida.Este método permite identificar atualmente usado e outros compostos para detectar o BK-poliomavírus através da atividade transcricional. Na expressão genética primitiva, isso determina decididamente a implicação viral. As gotas inibitórias podem ser consideradas como agentes para os pacientes imunocomprometidos no caso da reativação BK-poliomavírus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Classificação de fluxo e sequenciação Exome das células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genética

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Célula com base em ensaios de SINEUP não-codificante RNAs que especificamente podem melhorar a tradução de mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Usando o Sniper-Cas9 para minimizar efeitos fora do alvo de CRISPR-Cas9 sem perda de atividade no alvo através de evolução dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Na aplicação do sistema de controle remoto para a manipulação da expressão do Gene endógeno de vivo

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...