Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Авторы благодарят Барбару Бликманн за отличную техническую помощь. Эти исследования были поддержаны IFORES-программой Медицинской школы Университета Дуйсбурга-Эссена и riMUR-программой Университетского альянса Рур и Научно-исследовательского центра Меркатора Рура (MERCUREl). Авторы благодарят юрген-Маншот-Стифтунг за докторскую стипендию Хелен Елене Серцниг и постоянную поддержку. Сбор и использование материалов для пациентов утверждены комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбург-Эссен (14-6028-BO).

Этот протокол следует руководящим принципам человеческих исследований, утвержденным комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбурга-Эссена (14-6028-BO).
1. Сбор образцов крови или мочи и изоляция ПОЛиомавируса ДНК
<ol><li>Соберите не менее 3 мл крови в трубка?...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

В этой статье представлен широко используемый метод, позволяющий проводить анализ некодирующего контроля региона BKPyV (NCCR), ориентированного на раннюю и поздняя активность промоутера. Активность NCCR может быть измерена одновременно и не нуждается в лизисе трансинфицированных клеток. Кр...

Полиомавирусы представляют собой независимое семейство небольших двухцепочечных вирусов ДНК (DsDNA) с вирусом Simian 40 (SV40) в качестве прототипа вида. Первичная инфекция в основном происходит в детстве, которые обычно проходят без симптомов заболевания и обычно вызывают скрытые инфекции у иммунных компетентных хозяев. BK-полиомавирус (BKPyV) в основном сохраняется в клетках почек труб, не вызывая нефропатологии, однако, в случае нарушения иммунокомпетентности после пересадки почек вирус может реактивироваться и вызвать серьезные повреждения и нарушения трансплантата функции при достижении высокой виремии (1 х 104 BKPyV копии ДНК / мл)1,2. Примерно в 10% реципиентов пересадки почки реактивация BK-полиомавируса (BKPyV) приводит к полиомавирусу, связанному с нефропатией (PyVAN), которая была до 80% связана с высоким риском отказов почечного аллотрансплантата3,4 . Поскольку утвержденных противовирусных препаратов нет, текущая терапия основана на снижении иммуносупрессии. Интересно, что ингибиторы mTOR, кажется, имеют противовирусный эффект; Таким образом, переключение иммуносупрессивной терапии на основе mTOR иммуносупрессии может представлять собой альтернативный подход для предотвращения прогрессирования виремии BKPyV5,6,7. Тем не менее, на основе mTOR противовирусный механизм в настоящее время все еще не полностью поняты. Таким образом, требуются методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов в клинически значимых концентрациях.
Круговой геном BKPyV состоит примерно из 5 кб укрывательство некодирования области управления (NCCR), который служит источником репликации и одновременно двунаправленный промоутер вождения выражение ранней и поздней фазы мРНК стенограммы. Так как спонтанно происходящие NCCR-перестановки, удаления и дублирования находятся в патогенных BKPyV8 и значительно накопленные у пациентов, страдающих от PVAN5,9, сравнение архетипических (WT) и переорганизованы (rr) NCCR-деятельности полезны для характеристики вирусных репликационных фитнес.
Как резюмируется на рисунке 1, этот протокол описывает широко используемый метод для измерения BKPyV NCCR транскрипционной активности путем количественной оценки флуоресценции двух фторофоров tdTomato и eGFP, выраженный от репортера плазмид5, 9,10,11. Процедура проводится в присутствии большого T-антигена SV40 (lTAg), который позволяет анализировать влияние потенциальных противовирусных препаратов на ранние и поздние NCCR-активности отдельно5. Этот анализ далее анализирует влияние перестановок на деятельность НККР и сравнение с wt-NCCRs5,9. Репортер плазмид гавани SV40 конце полиаденилации сигнала вниз по течению каждого флюорофора открытой рамки чтения для обеспечения сопоставимой и эффективной обработки как стенограммы для tdTomato и eGFP, соответственно. По сравнению с qRT-PCR на основе методов5,12, этот подход на основе FACS представляет собой низкую стоимость и высокую пропускную плату совместимой альтернативой, поскольку нет сложных протоколов экстракции для инфицированной культуры клеток и не дорого антитела для иммунной флуоресценции окрашивания необходимы. Кроме того, поскольку определенное количество флуоресцентных клеток анализируются с помощью цитометрии потока, анализ ингибирующих клеточного цикла также возможен в количественном выражении.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Полиомавирусы, такие как BK-полиомавирус (BKPyV), могут вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом. Однако, поскольку высокоэффективные противовирусные препараты в настоящее время отсутствуют, необходимы методы измерения воздействия потенциальных противовирусных препаратов. Здесь, двойной флуоресценции репортер, который позволяет анализ BKPyV не-кодирования контроля региона (NCCR) инициативе ранней и поздней активности промоутера был построен для количественной оценки воздействия потенциальных противовирусных препаратов на экспрессию вирусных генов через tdTomato и eGFP Выражение. Кроме того, путем клонирования BKPyV-NCCR ампликонов, которые в этом протоколе были образцово получены из крови полученных ДНК иммунокомпромиссных пациентов пересадки почек, влияние NCCR-перестановки на экспрессию вирусного гена может быть определено. После клонирования пациента, полученных ампликонов, HEK293T клетки были трансфицированы с репортером плазмиды, и лечение с потенциальными противовирусными агентами. Впоследствии клетки были подвергнуты FACS-анализ для измерения средней интенсивности флуоресценции 72 ч после трансфекции. Для проверки анализа препаратов, которые имеют потенциальный клеточный цикл ингибирующего эффекта, используются только трансфицирующие и, таким образом, флуоресцентные клетки. Так как этот анализ проводится в больших T Антигена выражая клетки, влияние раннего и позднего выражения могут быть проанализированы в взаимно независимым образом.

В этом репрезентативном эксперименте, BK-полиомавирус Не-Кодирование Контрольный регион управляемых транскрипционной активности была измерена с помощью цитометрии потока. Кроме того, ингибитор mTOR, который может быть использован для лечения пациентов после реактивац...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Измерение BK-полиомавируса Некодирования Контроль региона Driven транскрипционной активности через поток цитометрии

В этой рукописи представлен протокол для выполнения FACS-измерения транскрипционной активности BK-полиомавируса с помощью клеток HEK293T, трансфицированных двунаправленным репортером плазмидом, выражающим tdTomato и eGFP. Этот метод позволяет дополнительно количественно определить влияние новых соединений на вирусную транскрипцию.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Общая цель этого протокола заключается в измерении БК-полиомавирусной некодирующей области контроля, обусловленной транскрипционные активности путем измерения двойной флуоресцентных клеток с помощью цитометрии потока. БК-полиомавирус может вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом, особенно у реципиентов пересадки почек. Однако, поскольку высокоэффективный антивирус в настоящее время недоступен, необходимы методы измерения потенциального антивирусного воздействия других соединений.Этот метод позволяет вирусологам анализировать влияние потенциальных противовирусных агентов, влияющих на транскрипционную активность БК-полиомавируса, обусловленную некодирующей областью контроля. Этот анализ позволяет также изучить влияние перестановок на активность промоутера по сравнению с архетипическими некодирующих контрольных регионов. Преимущество изучения вирусной активности промоутер с двойной флуоресценции доклад является то, что ранняя и поздняя экспрессия генов могут быть проанализированы в взаимно независимой манере.Кроме того, трудная перфорация вирусных запасов и долгосрочные эксперименты по культуре инфекционных клеток не являются необходимыми, поскольку анализируются только трансфицированные и флуоресцентные клетки, а также изучаются препараты, снижающие жизнеспособность клеток и перфорацию. Этот протокол соответствует руководящим принципам человеческих исследований, утвержденным комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбурга-Эссена. Первым шагом является сбор образцов крови для изоляции полиомавирусной ДНК.Соберите не менее трех миллилитров крови в трубках EDTA приобретения. Центрифуга образца на 2500 Г в течение 15 минут и пипетки плазмы в новую трубку. Приготовьте 40 микролитров белка SK в 1,5 миллилитровую микро-центрифугу и добавьте 400 микролитров плазмы путем пипетки.Изолировать ДНК с помощью набора экстракции пятна ДНК, как описано в инструкциях производителя. Подготовь мастер-микс для предварительного ПЦР с помощью грунтовки пары А общим объемом 50 микролитров и используйте ранее изолированную ДНК. Распределите 45 микролитров мастер-микса в ПЦР-трубки.Добавьте пять микролитров изолированной ДНК в трубки ПЦР и запустите ПЦР с условиями реакции, как показано в таблице 3. Повторите денатурацию и расширение в 35 циклов. Для вложенных приложений используйте грунтовую пару B, укрывая сайты ограничений для клонирования.Смешайте 10 микролитров продукта ПЦР с двумя микролитров шестикратного гелеобразного красителя. Загрузите 10 микролитров смеси на гель 1.5%agarose и запустите гель в течение 30 минут при 60 миллиампере. Визуализуйте гель с помощью соответствующей уф-системы документации.Очистите ПЦР-ампликонов с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Усваивается очищенные ампликоны с ферментами ограничения индикатора в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Повторите шаги очистки для очистки переваренных ампликонов.Параллельно, также переварить плазмидный позвоночник. Проанализируйте переваренный плазмидный хребет на 0,8% низкого крепления агарозного геля. Не запускать гель при более высоком токе, чем 40 миллиампер.Визуализуйте фрагменты ДНК с помощью длинноволнового УФ-излучения и вырежьте изогнутый позвоночник с помощью чистого скальпеля. Избегайте длительного времени УФ-облучения, чтобы предотвратить повреждение ДНК. Забор для фрагмента фломель геля в новую 1,5 миллилитровую микро-центрифугу трубки.Нагрейте позвоночник, содержащий низкий режим агарозы кусок в течение 10 минут при температуре 65 градусов по Цельсию для того, чтобы расплавить гель кусок и смешивать каждые две минуты нежным вихрем. Расплавленный гель может быть непосредственно использован для перевязки. Лигат позвоночника и переваренный ампликсон с использованием T4 ДНК лигазы ночь при 16 градусов по Цельсию.После стандартной процедуры клонирования изолируйте ДНК плазмы. Выполните ограничение пищеварения фермента, чтобы проверить положительные клоны и визуализировать переваренные фрагменты на 1%agarose гель. Семя 100 000 HEK293T клеток на колодец 12 пластины хорошо 24 часов до трансфекции и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию, поддерживать активное распространение во время трансфекции.Клетки должны быть примерно на 80%слияние при трансфекции. Поместите 250 микролитров уменьшенных средств сыворотки в стерильную трубку и добавьте по одному микрограмму каждой зарегистрированной плазменной ДНК и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Добавьте три микролитров трансфектного реагента в смесь ДНК и аккуратно перемешайте трубами и инкубировать в течение 15 минут при 22 градусах Цельсия.Добавить смесь, падение мудрый колодец и аккуратно распределить в колодец. Через четыре часа замените супернатант свежей средой, содержащей испытательные агенты и растворителя. В этом примере были использованы ингибиторы мТОР INK-128 и рапамицин.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию до анализа. Проверьте клетки на наличие красной и зеленой флуоресценции под микроскопом флуоресценции. Красная и зеленая флуоресценция соответствуют ранней и поздней экспрессии гена БК-полиомавируса соответственно.72 часа после трансфекции, тщательно стремитесь к супернатанту. Вымойте клетки дважды с одним миллилитров холодного PBS. Аккуратно добавьте 500 микролитров трипсина и поверните пластину немного, чтобы избежать преждевременного отслоения клеток.Этот шаг имеет важное значение, чтобы избежать дублетов клеток. После добавления, трипсин удаляется непосредственно с той же наконечником пипетки. Инкубировать клетки, по крайней мере пять минут при 37 градусов по Цельсию.Повторно приостановить трипсин S клетки с одним миллилитром PBS, содержащий 3%FCS и передачи подвески в предварительно помеченных facS труб. Добавьте DAPI при концентрации одного микрограмма на миллилитр до анализа FACS. Анализируйте клетки с помощью цитометра потока.Для каждого образца, мера по крайней мере 10000 живых клеток. Первоначальная компенсация имеет важное значение для различения красных и зеленых сигналов для достижения точных результатов. Регент управления, не связанный с кодированием, был усилен с помощью вложенного протокола ПЦР с использованием внутренней грунтовки, которая укрывает места ограничения для клонирования.Проверка ампликона проводилась с помощью электрофорезов агарозового геля, в то время как ампликоны, полученные из архетипических последовательностей NCCR при однородном распределении размеров в геле, полученные из перестроенных NCCRs с вставками и удалениями, отличались по размеру. Выбор положительных клонов, содержащих NCCR, был проверен анализом ограничений. Область малых космических пространств была заменена более крупными фрагментами NCCR, указывающими на положительные клоны.Плазмидная ДНК, выделенная из проверенных клонов, была отправлена на пирозекку. В этом примере было обнаружено удаление в P-блоке и замена в O-блоке. Клетки HEK293T были временно трансфицированы с уважением к отчетной конструкции, а активность NCCR контролировалась с помощью микроскопии флуоресценции.Красные и зеленые флуоресцентные лампы соответствовали ранней и поздней экспрессии гена БК-полиомавируса соответственно. Первый NCCR показал сильную позднюю экспрессию генов, в то время как второй пример имел сравнительно сильную раннюю, но умеренную позднюю экспрессию генов. Отрицательные ячейки DAPI были закрыты, и был создан точечный сюжет, показывающий eGFP против tdTomato.Образцы, которые были отрицательными, а также положительные только для tdTomato или eGFP были включены в анализ. Средние интенсивности флуоресценции были получены от каждого клона тестирования. В этом примере, лечение с двойным ингибитором mTOR INK128 значительно сократило tdTomato МФО, что означает, что раннее выражение было ингибировано.Этот метод позволяет определить используемые в настоящее время и другие соединения для обнаружения БК-полиомавируса с помощью транскрипционные действия. В ранней экспрессии генов, это решительно определяет вирусный подтекст. Ингибиторные капли могут рассматриваться как агенты для пациентов с ослабленным иммунитетом в случае реактивации БК-полиомавируса.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

РНК Pull-down процедура для определения целей РНК РНК, длиной некодирующих

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Ячейки на основе анализов SINEUP кодирования РНК, которые могут конкретно улучшить перевод мРНК

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

С помощью снайпера Cas9 для сведения к минимуму последствий пробить ТРИФОСФАТЫ Cas9 без потери на цель деятельности через направленной эволюции

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Искусственные РНК-полимераза II Удлинение Комплексы для вскрытия co-транскрипционной РНК обработки событий

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...