Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Los autores agradecen a Barbara Bleekmann por su excelente asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por el programa IFORES de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen y el programa RIMUR de la Alianza Universitaria Ruhr y Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Los autores agradecen a los J. Manchot-Stiftung por la beca de doctorado de Helene Sertznig y el apoyo constante. La recolección y el uso de material para pacientes ha sido aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Recolección de muestras de sangre u orina y aislamiento del ADN del poliomavirus
<ol><li>Recoger al menos 3 ml de sangre en tubos EDTA u orina en tubos de adquisición.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 15 min. Si es necesario, pipetee el plasma en un tubo nuevo y almacene las muestras de ...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

En este artículo, se presenta un método comúnmente utilizado que permite el análisis de la actividad de promotor estinúo no codificante (NCCR) impulsada por la actividad temprana y tardía del promotor. La actividad del NCCR se puede medir simultáneamente y no necesita lisis de las células transinfectadas. Además, se puede analizar un número relativamente grande de células y no es necesario la co-transfección de marcadores adicionales para la normalización de los valores de fluorescencia.
<p class="jove_c...

Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una viremia alta (1 x 104 copias de ADN BKPyV/ml)1,2. En aproximadamente el 10% de los receptores de trasplante de riñón, la reactivación del BK-poliomavirus (BKPyV) da como resultado una nefropatía asociada al poliomavirus (PyVAN), que se asoció hasta un 80% con un alto riesgo de fallos de aloinjerto renal3,4 . Dado que no se dispone de agentes antivirales aprobados, el tratamiento actual se basa en la reducción de la inmunosupresión. Curiosamente, inhibidores de mTOR parecen tener un efecto antiviral; por lo tanto, cambiar la terapia inmunosupresora a la inmunosupresión basada en mTOR podría representar un enfoque alternativo para prevenir la progresión de la viremia BKPyV5,6,7. Sin embargo, el mecanismo antiviral basado en mTOR todavía se entiende incompletamente. Por lo tanto, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales en concentraciones clínicamente relevantes.
El genoma circular del BKPyV consiste en aproximadamente 5 kb que albergan una región de control no codificante (NCCR) que sirve como origen de la replicación y concomitantemente un promotor bidireccional que impulsa la expresión de transcripciones de ARNm de fase temprana y tardía. Dado que los reordenamientos, deleciones y duplicaciones del NCCR de origen espontáneo se encuentran en el BKPyV8 patógeno y se acumulan significativamente en pacientes que sufren de PVAN 5,9, una comparación de arquetípicos (wt) y re-arreglado (rr) Las actividades del NCCR son útiles para caracterizar la aptitud replicativa viral.
Como se resume en la Figura 1, este protocolo describe un método comúnmente utilizado para medir la actividad transcripcional BKPyV NCCR cuantificando la fluorescencia de dos fluoróforos tdTomato y eGFP expresadas a partir de un reportero plásmido5, 9,10,11. El procedimiento se realiza en presencia del antígeno T grande SV40 (lTAg), que permite analizar el impacto de los posibles agentes antivirales en la actividad temprana y tardía del NCCR por separado5. Este ensayo analiza más a fondo el impacto de los reordenamientos en la actividad del NCCR y la comparación con los WT-NCCRs5,9. El plásmido reportero alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada marco de lectura abierto de fluoróforo para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato y eGFP, respectivamente. En comparación con los métodos basados en qRT-PCR5,12, este enfoque basado en FACS representa una alternativa compatible de bajo costo y alto rendimiento, ya que no hay protocolos de extracción complicados para el cultivo celular infectado y no costoso se necesitan anticuerpos para la tinción de fluorescencia inmune. Además, dado que una cantidad definida de células fluorescentes se analizan a través de la citometría de flujo, el análisis de los agentes inhibidores del ciclo celular también es posible de manera cuantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Los poliomavirus, como el BK-poliomavirus (BKPyV), pueden causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, dado que actualmente no se dispone de antivirales altamente eficaces, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales. Aquí, se construyó un reportero de doble fluorescencia que permite el análisis de la región de control no codificante BKPyV (NCCR) impulsada por la actividad promotora temprana y tardía para cuantificar el impacto de los posibles medicamentos antivirales en la expresión génica viral a través de tdTomato y eGFP Expresión. Además, mediante la clonación de los amplicones BKPyV-NCCR que en este protocolo se han obtenido ejemplarmente del ADN derivado de la sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos, se puede determinar el impacto de los reordenamientos del NCCR en la expresión génica viral. Tras la clonación de los amplicons derivados del paciente, las células HEK293T fueron transinfectadas con los plásmidos del reportero y tratadas con posibles agentes antivirales. Posteriormente, las células fueron sometidas a análisis FACS para medir intensidades medias de fluorescencia 72 h después de la transfección. Para probar también el análisis de fármacos que tienen un potencial efecto inhibidor del ciclo celular, sólo se utilizan células transinfectadas y por lo tanto fluorescentes. Dado que este ensayo se realiza en células grandes que expresan el antígeno T, el impacto de la expresión temprana y tardía se puede analizar de una manera mutuamente independiente.

En este experimento representativo, la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus se midió a través de la citometría de flujo. Además, se probó la inhibición de la expresión génica temprana viral para tratar a los pacientes después de la reactivación del BKPyV. Con este fin, se utilizó un ensayo de doble fluorescencia-reportero como publicado anteriormente5. El esquema de flujo de trabajo general de la c...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo

En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

El objetivo general de este protocolo es medir la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificantes BK-polyomavirus midiendo las células fluorescentes duales a través de la citometría de flujo. El BK-poliomavirus puede causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos, especialmente en los receptores de trasplante renal. Sin embargo, dado que los antivirus altamente eficaces actualmente no están disponibles, se requieren métodos que miden el impacto potencial antiviral de otros compuestos.Este método permite a los virólogos analizar el impacto de los posibles agentes antivirales que afectan a la actividad transcripcional BK-polyomavirus impulsada por la región de control no codificante. Este ensayo permite estudiar aún más la influencia de los reordenamientos en la actividad del promotor en comparación con las regiones de control arquetípicas no codificantes. La ventaja de estudiar la actividad promotora viral con un informe de fluorescencia dual es que la expresión génica temprana y tardía puede ser analizada de manera mutuamente independiente.Además, la difícil perforación de las poblaciones de virus y los experimentos de cultivo celular infeccioso a largo plazo no son necesarios, ya que sólo se analizan las células trans infectadas y fluorescentes, también se pueden estudiar fármacos que reducen la viabilidad celular y la perforación. Este protocolo sigue las directrices de la investigación humana aprobadas por el comité ético de la facultad de medicina de la Universidad de Duisburg-Essen. El primer paso es recoger muestras de sangre para el aislamiento del ADN del poliomavirus.Recoger al menos tres mililitros de sangre en tubos de adquisición de EDTA. Centrifugar la muestra a 2.500 G durante 15 minutos y pipetear el plasma en un tubo nuevo. Preparar 40 microlitros de proteína SK en un tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros y añadir 400 microlitros de plasma por pipeteo.Aísle el ADN utilizando un kit de extracción de manchas de ADN como se describe en las instrucciones del fabricante. Prepare la mezcla maestra para el pre-PCR utilizando el par de imprimación A en un volumen total de 50 microlitros y utilice el ADN previamente aislado. Distribuya 45 microlitros de la mezcla maestra en los tubos PCR.Agregue cinco microlitros del ADN aislado a los tubos de PCR y ejecute la PCR con las condiciones de reacción como se ilustra en la tabla tres. Repita el recocido y la extensión de la desnaturalización en 35 ciclos. Para la aplicación anidada, utilice el par de imprimación B, que alberga los sitios de restricción para la clonación.Mezclar 10 microlitros del producto PCR con dos microlitros de seis veces de colorante de carga de gel. Cargue 10 microlitros de la mezcla en un gel de 1,5% de agarosa y ejecute el gel durante 30 minutos a 60 miliamperios. Visualice el gel utilizando un sistema de documentación UV adecuado.Purifique el amplicons PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Digerir el amplicons purificado con las enzimas de restricción del indicador durante dos horas a 37 grados centígrados. Repita los pasos de purificación para purificar los amplicons digeridos.Paralelamente, también digerir la columna vertebral del plásmido. Analizar la columna vertebral del plásmido digerido en un gel de agarosa de montaje bajo al 0,8%. No ejecute el gel a una corriente superior a 40 miliamperios.Visualice fragmentos de ADN usando luz UV de onda larga y corte la columna vertebral doblada usando un bisturí limpio. Evite tiempos de exposición UV largos para prevenir daños en el ADN. Cerca para la pieza de fragmento de gel de flomel en un nuevo tubo de micro-centrífuga de 1,5 mililitros.Calienta la columna vertebral que contiene la pieza de agarosa de modo bajo durante 10 minutos a 65 grados Celsius para derretir la pieza de gel y mezclar cada dos minutos mediante un vórtice suave. El gel fundido se puede utilizar directamente para la ligadura. Espina dorsal ligada y el amplicon digerido usando ligasa de ADN T4 durante la noche a 16 grados centígrados.Después del procedimiento de clonación estándar, aísle el ADN plasmático. Realizar la digestión enzimática de restricción para comprobar si hay clones positivos y visualizar fragmentos digeridos en un gel de 1% de agarosa. Semilla 100,000 células HEK293T por pozo de la placa de 12 pozos 24 horas antes de la transfección e incubar durante la noche a 37 grados Celsius, mantener la proliferación activa durante la transfección.Las células deben estar aproximadamente al 80% de confluencia en la transfección. Coloque 250 microlitros de medios séricos reducidos en tubo estéril y agregue un microgramo de cada ADN plasmático reportado y mezcle suavemente por pipeteo. Añadir tres microlitros del reactivo de transfección a la mezcla de ADN y mezclar suavemente por pipeteo e incubar durante 15 minutos a 22 grados Centígrados.Agregue la mezcla, deje caer al pozo y distribuya suavemente al pozo. Después de cuatro horas, sustituya el sobrenadante por un medio fresco que contenga los agentes de prueba y el control de disolventes. En este ejemplo, se utilizaron los inhibidores mTOR INK-128 y rapamicina.Incubar a 37 grados centígrados hasta el análisis. Compruebe si las células tienen fluorescencia roja y verde bajo el microscopio de fluorescencia. La fluorescencia roja y verde corresponde a la expresión génica BK-poliomavirus temprana y tardía, respectivamente.72 horas después de la transfección, aspirar cuidadosamente al sobrenadante. Lave las células dos veces con un mililitro de PBS frío. Agregue suavemente 500 microlitros de trippsina y gire la placa ligeramente para evitar el desprendimiento prematuro de las células.Este paso es importante para evitar los dobletes de celda. Después de la adición, la trippsina se elimina directamente con la misma punta de pipeta. Incubar las células durante al menos cinco minutos a 37 grados centígrados.Re-suspenda las células de tripsina S con un mililitro PBS que contiene 3%FCS y transfiera la suspensión en tubos FACS preetiquetados. Añadir DAPI a una concentración de un microgramo por mililitro antes del análisis de FACS. Analice las células utilizando un citometro de flujo.Para cada muestra, mida al menos 10.000 células vivas. La compensación inicial es esencial para distinguir las señales rojas y verdes para lograr resultados precisos. El regente de control no codificante se amplió utilizando un protocolo PCR anidado utilizando el par de imprimación interna que alberga los sitios de restricción para la clonación.La verificación del amplicon se realizó a través de la electroforesis de gel de agarosa Mientras que los amplicons derivados de secuencias arquetípicas NCCR en una distribución de tamaño homogéneo en el gel, los derivados de los NCCR reorganizados con inserciones y eliminaciones, diferían en su tamaño. La selección de clones positivos que contienen el NCCR se verificó mediante un análisis de restricciones. La pequeña región espaciadora fue reemplazada por los fragmentos NCCR más grandes que indican clones positivos.El ADN plásmido aislado de clones verificados fue enviado para la pirosecuenciación. En este ejemplo, se detectaron la eliminación en el bloque P y la sustitución en el bloque O. Las células HEK293T fueron transfectadas transitoriamente con el respeto de la construcción reportable y la actividad del NCCR fue monitoreada por una microscopía de fluorescencia.Los fluorescentes rojos y verdes correspondían a la expresión génica BK-poliomavirus temprana y tardía respectivamente. El primer NCCR mostró una fuerte expresión génica tardía, mientras que el segundo ejemplo tuvo una expresión génica tardía relativamente fuerte, pero moderada. Las celdas negativas DAPI fueron cerradas y se creó una gráfica de puntos que muestra eGFP versus tdTomato.Las muestras que fueron negativas, así como las positivas para tdTomato o eGFP sólo se incluyeron en el análisis. Las intensidades medias de fluorescencia se derivaron de cada clon de prueba. En este ejemplo, el tratamiento con el inhibidor de mTOR dual INK128 redujo significativamente la IMF tdTomato, lo que significa que se inhibió la expresión temprana.Este método permite identificar los compuestos utilizados actualmente y otros compuestos para detectar el BK-poliomavirus a través de la actividad transcripcional. En la expresión génica temprana, esto determina decididamente la implicación viral. Las gotas inhibidoras pueden considerarse utilizadas como agentes para los pacientes inmunocomprometidos en el caso de reactivación del BK-poliomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Clasificación de flujo y secuenciación exome de las células Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Investigación

Genética

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Procedimiento de ARN Pull-down para identificar dianas de ARN de un ARN largo no codificante

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Celular basado en análisis de SINEUP no-codificación RNAs que específicamente pueden mejorar la traducción del mRNA

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Uso de francotirador Cas9 para minimizar efectos Off-target de CRISPR Cas9 sin la pérdida de actividad en blanco mediante evolución dirigida

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluación de una reacción en cadena de la polimerasa de la transcripción inversa anidada universal para la detección de Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...