Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Författarna tackar Barbara Bleekmann för utmärkt teknisk hjälp. Dessa studier stöttades av IFORES-programet av universitetar av Duisburg-Essen läkarundersökning skolar och RIMUREN-programet av Universitetaralliansen Ruhr och Mercator forskning centrerar Ruhr (MERCUR). Författarna tackar Jürgen-Manchot-Stiftungen för doktorat gemenskap av Helene Sertznig och konstant service. Insamling och användning av patientmaterial har godkänts av etikkommittén för den medicinska fakulteten vid universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).

Detta protokoll följer de riktlinjer för mänsklig forskning som godkänts av etikkommittén för medicinska fakulteten vid universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. insamling av blod-eller urinprov och isolering av polyomavirus DNA
<ol><li>Samla in minst 3 mL blod i EDTA-rör eller urin i inhämtande rör.</li>
	<li>Centrifugera provet på 2 500 x g i 15 min. Vid behov Pipettera plasma i ett nytt rör och förvara plasmaproverna vid 4 ° c i flera dagar eller frys vid-20 °...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

I den här artikeln presenteras en vanlig metod som gör det möjligt för analys av BKPyV icke-kodning Control-region (NCCR) driven tidig och sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan mätas samtidigt och behöver inte lys av de transfekterade cellerna. Dessutom kan ett relativt stort antal celler analyseras och co-transfektion av ytterligare markörer för normalisering av fluorescensvärden är inte nödvändigt.
En kritisk del av denna metod är att den klonade nccr bör innehålla exak...

Polyomaviruses representerar en självständig familj av små dubbelsträngade DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototyp art. Den primära infektionen uppstår främst under barndomen, som vanligtvis fortsätter utan sjukdomssymtom och oftast orsaka latent infektioner i immunförsvaret kompetenta värdar. BK-polyomavirus (BKPyV) består i huvudsak av njurtubuli celler utan att orsaka nefropatier, men i händelse av försämring av immun-kompetensen efter njurtransplantation kan viruset återaktivera och orsaka allvarliga skador och försämrad transplantat funktion när man når en hög viremia (1 x 104 bkpyv DNA kopior/ml)1,2. Hos cirka 10% av mottagarna av njurtransplantat, reaktivering av BK-polyomavirus (bkpyv) resulterar i en polyomavirus associerad nefropati (pyvan), som var upp till 80% förknippad med en hög risk för renal allograffel3,4 . Eftersom inga godkända antivirala medel finns tillgängliga, är nuvarande behandling baserad på reduktion av immunsuppression. Intressant, mTOR-hämmare verkar ha en antiviral effekt; Således, byta immunsuppressiv behandling till mTOR-baserad immunsuppression kan utgöra en alternativ metod för att förhindra progression av bkpyv viremia5,6,7. Men den mTOR-baserade antivirala mekanismen är för närvarande fortfarande ofullständigt förstådd. Därför krävs metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel i kliniskt relevanta koncentrationer.
Den cirkulära genomet i BKPyV består av cirka 5 KB härbärga en icke-kodning kontroll region (NCCR) som fungerar som ett ursprung för replikering och samtidigt en dubbelriktad promotor kör uttrycket av tidiga och sena fas mRNA utskrifter. Eftersom spontant förekommande nccr-omordningar, borttagningar och dubbleringar påträffas i patogena bkpyv8 och ackumuleras signifikant hos patienter som lider av PVAN-5,9, en jämförelse av arketetypikal (WT) och omarrangerade (RR) NCCR-aktiviteter är till hjälp för att karakterisera viral replikativ kondition.
Som sammanfattas i figur 1, beskriver detta protokoll en metod som ofta används för att mäta BKPyV nccr-transkriptionsaktivitet genom att kvantifiera fluorescensen hos två fluorofomedel tdTomato och egfp som uttrycks från en reporter plasmid5, 9,10,11. Förfarandet utförs i närvaro av SV40 stora T-antigen (lTAg), som gör det möjligt att analysera effekterna av potentiella antivirala medel på tidig och sen NCCR-aktivitet separat5. Denna analys analyserar ytterligare effekten av omordningar på nccr-aktiviteten och jämförelse med WT-nccrs5,9. Reportern plasmid hamnar den SV40 sena polyadenylering signalen nedströms varje fluorophore öppen läsbild för att säkerställa jämförbar och effektiv bearbetning av båda avskrifter för tdTomato och eGFP, respektive. Jämfört med QRT-PCR-baserade metoder5,12, detta FACS-baserade tillvägagångssätt representerar en låg kostnad och hög genomströmning kompatibelt alternativ eftersom inga komplicerade utvinning protokoll för infekterade cellkulturen och inga dyra antikroppar mot immunfluorescens färgning behövs. Dessutom, eftersom en definierad mängd fluorescerande celler analyseras via flödescytometri, är analysen av cell cykelhämmande medel också möjligt på ett kvantitativt sätt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

Polyomaviruser, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan orsaka allvarliga patologier hos patienter med nedsatt immunförsvar. Eftersom mycket effektiva antivirala läkemedel för närvarande inte är tillgängliga krävs dock metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel. Här har en dubbel fluorescensreporter som gör det möjligt att analysera den icke-kodande kontroll region (NCCR) som är driven i början och slutet av promotorn för att kvantifiera effekten av potentiella antivirala läkemedel på virus genuttryck via tdTomato och eGFP Uttryck. Genom kloning av BKPyV-NCCR-amplikoner som i detta protokoll exemplärt har erhållits från det blodbaserade DNA hos immunsupprimerade njurtransplanterade patienter kan effekten av NCCR-omordningar på viral genuttryck bestämmas. Efter kloning av patienten härledda amplicons, HEK293T celler var transfekterade med rapportör-plasmider, och behandlas med potentiella antivirala medel. Därefter utsattes celler för FACS-analys för mätning av medelvärdet för fluorescensintensiteter 72 h efter transfektion. För att också testa analysen av läkemedel som har en potentiell cell cykelhämmande effekt, endast transfekterade och därmed fluorescerande celler används. Eftersom denna analys utförs i stora T antigen uttrycker celler, effekterna av tidigt och sent uttryck kan analyseras på ett ömsesidigt oberoende sätt.

I detta representativa experiment mättes BK-polyomavirus icke-kodande kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri. Dessutom testades en mTOR-hämmare, som kan användas för att behandla patienter efter reaktivering av BKPyV, för sin hämning av det virala tidiga genuttrycket. För detta ändamål användes en dual Fluorescence-reporter-analys som publicerades tidigare5. Det övergripande arbetsflödessystemet i den experimentella insta...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Mätning av BK-polyomavirus icke-kodning kontroll region driven transkriptionell aktivitet via flödescytometri

I detta manuskript, ett protokoll presenteras för att utföra FACS-baserade mätningar av BK-polyomavirus transkriptionell aktivitet genom att använda HEK293T celler transfekterade med en dubbelriktad reporter plasmid uttrycker tdtomato och egfp. Denna metod gör det möjligt att kvantitativt bestämma påverkan av nya föreningar på viral transkription.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Det övergripande syftet med detta protokoll är att mäta BK-polyomavirus icke-kodande kontrollregion driven transkriptionell aktivitet genom att mäta dubbla fluorescerande celler via flödescytometri. BK-polyomavirus kan orsaka allvarliga patologier i immunkomprometterade patienter, särskilt i njurtransplantat mottagare. Men eftersom mycket effektiva antivirusprogram för närvarande inte är tillgängliga, krävs metoder som mäter den potentiella anti-virala effekten av andra föreningar.Denna metod gör det möjligt för virologer att analysera effekterna av potentiella anti-virala medel som påverkar BK-polyomavirus transkriptionell aktivitet som drivs av icke-kodande kontroll regionen. Denna analys gör det möjligt att studera påverkan av rearrangements på promotorn verksamhet i jämförelse med archetypical icke-kodning kontroll regioner. Fördelen med att studera viral promotorn verksamhet med en dubbel fluorescens rapport är att tidiga och sena genuttryck kan analyseras på ett ömsesidigt oberoende sätt.Vidare är den svåra perforeringen av viruslager och långsiktiga infektionscellkulturexperiment inte nödvändiga eftersom endast transfekterade och fluorescerande celler analyseras, även läkemedel som minskar cellens livskraft och perforering kan studeras. Detta protokoll följer riktlinjerna för mänsklig forskning som godkänts av etik kommitté av den medicinska fakulteten vid universitetet i Duisburg-Essen. Det första steget är att samla in blodprov för isolering av polyomavirus DNA.Samla in minst tre milliliter blod i EDTA förvärvsrör. Centrifugera provet vid 2, 500 G i 15 minuter och pipettera plasman till ett nytt rör. Förbered 40 mikroliter protein SK i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och tillsätt 400 mikrolitersplasma genom pipettering.Isolera DNA:t med hjälp av en extraktionssats för DNA-blot enligt beskrivningen i tillverkarens anvisningar. Förbered mastermixen för pre-PCR med hjälp av primerpar A i en total volym på 50 mikroliter och använd det tidigare isolerade DNA: t. Fördela 45 mikroliter av mastermixen i PCR-rören.Lägg till fem mikroliter av det isolerade DNA i PCR-rören och kör PCR med reaktionsförhållandena som illustreras i tabell tre. Upprepa denaturering glödgning och förlängning i 35 cykler. För kapslade ansökan, använd primer par B, hyser begränsningen platser för kloning.Blanda 10 mikroliter av PCR-produkten med två mikroliter av sexfaldigt gel loading dye. Ladda 10 mikroliter av blandningen på en 1,5%agarosgel och kör gelen i 30 minuter vid 60 milliampere. Visualisera gelen med hjälp av ett lämpligt UV-dokumentationssystem.Rena PCR-amplikonerna med hjälp av en PCR-reningssats enligt tillverkarens anvisningar. Digest de renade amplifierar med indikatorbegränsningsenzymerna för två timmar på 37 grader Celsius. Upprepa reningsstegen för att rena de rötade amplikerna.Parallellt, också smälta plasmid ryggraden. Analysera den smälta plasmid ryggraden på en 0,8%låg mount agaros gel. Kör inte gelen vid en högre ström än 40 milliampere.Visualisera DNA-fragment med hjälp av långvågs UV-ljus och skär ut ryggraden böjd med hjälp av en ren skalpell. Undvik långa UV-exponeringstider för att förhindra DNA-skador. Staket för bit flomel gel fragment i en ny 1,5 milliliter mikro-centrifugrör.Värm ryggraden som innehåller lågläges-agarosstycke i 10 minuter vid 65 grader Celsius för att smälta gelbiten och blanda varannan minut genom mild virvelning. Den smälta gelen kan direkt användas för ligering. Ligate ryggrad och smält amplikon med T4 DNA ligase över natten vid 16 grader Celsius.Efter standard kloningsproceduren isolerar du plasma-DNA: t. Utför begränsningsenzym matsmältning för att kontrollera om positiva kloner och visualisera rötade fragment på en 1%agarosgel. Frö 100, 000 HEK293T celler per brunn av 12 brunnsplattan 24 timmar före transfektion och inkubera över natten vid 37 grader Celsius, upprätthålla aktiv spridning under transfection.Celler bör vara ungefär vid 80%konfluency vid transfection. Placera 250 mikroliter av reducerade serummedia i sterilt rör och tillsätt ett mikrogram av varje rapporterat plasma-DNA och blanda försiktigt genom pipettering. Tillsätt tre mikroliter av transfektionsreagensen till DNA-blandningen och blanda försiktigt genom pipettering och inkubera i 15 minuter vid 22 grader Celsius.Tillsätt blandningen, droppvis till brunnen och fördela försiktigt till brunnen. Efter fyra timmar, byt supernatanten mot färskt medium som innehåller testmedel och lösningsmedelskontroll. I detta exempel användes mTOR-hämmarna INK-128 och rapamycin.Inkubera vid 37 grader Celsius tills analysen. Kontrollera celler för röd och grön fluorescens under fluorescensmikroskopet. Röd och grön fluorescens motsvarar den tidiga och sena BK-polyomavirus genuttryck respektive.72 timmar efter transfection, noggrant aspirera supernatanten. Tvätta cellerna två gånger med en milliliter kall PBS. Tillsätt försiktigt 500 mikroliters trypsin och vrid plattan något för att undvika för tidig bortlossning av cellerna.Detta steg är viktigt för att undvika celldubbel. Efter dessutom avlägsnas trypsin direkt med samma pipettspets. Inkubera cellerna i minst fem minuter vid 37 grader Celsius.Åter upphäva trypsin S-celler med en milliliter PBS innehållande 3%FCS och överför suspensionen i förmärkta FACS-rör. Lägg till DAPI vid en koncentration på ett mikrogram per milliliter före FACS-analys. Analysera cellerna med hjälp av en flödescytometer.För varje prov, mät minst 10, 000 levande celler. Inledande ersättning är avgörande för att skilja röda och gröna signaler för att uppnå korrekta resultat. Den icke-kodande kontroll regent förstärktes med hjälp av en kapslad PCR-protokollet med hjälp av den inre primer par som hyser begränsning platser för kloning.Amplikonverifieringen utfördes via agarosgelelektrofores Medan de ampliconer som härstammar från arketypiska NCCR-sekvenser vid en homogen storleksfördelning i gelen, skilde sig de som härleds från omarrangerade NCCRs med infogningar och deletioner, i sin storlek. Urvalet av positiva kloner som innehöll NCCR kontrollerades genom en begränsningsanalys. Den lilla distansregionen ersattes av de större NCCR-fragmenten som indikerar positiva kloner.Plasmid DNA isolerat från verifierade kloner skickades för pyrosequencing. I det här exemplet upptäcktes borttagningen i P-blocket och ersättningen i O-block. HEK293T celler var transiently transfected med respekt för reportable konstruera och NCCR verksamhet övervakades av en fluorescens mikroskopi.Röda och gröna fluoresceranden motsvarade tidigt respektive sent BK-polyomavirus genuttryck. Den första NCCR visas en stark sen gen uttryck medan det andra exemplet hade en jämförelsevis stark tidigt men måttlig sena genuttryck. DAPI negativa celler var gated och en punkt tomt skapades visar eGFP kontra tdTomato.Prover som var negativa liksom de positiva för tdTomato eller eGFP endast ingick i analysen. Medelfluorescensintensiteter härleddes från varje testklon. I detta exempel reducerade behandlingen med dubbel mTOR-hämmaren INK128 signifikant tdTomato MFI vilket innebär att tidigt uttryck hämmades.Denna metod gör det möjligt att identifiera för närvarande används och andra föreningar för att upptäcka BK-polyomavirus genom transkriptionell aktivitet. I tidiga genuttryck, detta bestämmer avgjort den virala implikationen. Hämmande droppar kan anses användas som medel för de immunkomprometterade patienterna när det gäller återaktivering av BK-polyomavirus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

RNA Pull-down förfarande att identifiera RNA mål av en lång icke-kodande RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Cell baserat analyser av SINEUP icke-kodande RNAs som specifikt kan förbättra mRNA Översättning

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Med Sniper-Cas9 att minimera Off-target effekter av CRISPR-Cas9 utan förlust av på målet aktiviteten Via riktad Evolution

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Utvärdering av en Universal kapslad omvänd transkription polymerase kedje reaktion för detektion av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...