Name: measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Yazarlar mükemmel teknik yardım için Barbara Bleekmann teşekkür ederiz. Bu çalışmalar, Duisburg-Essen Tıp Fakültesi 'nin IFORES-programı ve Üniversitesi Ittifak Ruhr ve Mercator araştırma merkezi Ruhr (MERCUR) RIMUR-programı tarafından destekleniyor. Yazarlar, Helene Sertznig 'in Doktora Bursu ve sürekli destek için Jürgen-Manchot-Stiftung ' a teşekkür ederler. Hasta materyalinin toplanması ve kullanımı, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

Bu protokol, Duisburg-Essen (14-6028-BO) Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanan insan araştırmaları yönergelerini takip eder.
1. kan veya idrar numunelerinin toplanması ve polyomavirüsdür DNA 'sı yalıtımı
<ol><li>EDTA tüpleri veya idrar edinme tüplerinde en az 3 mL kan toplayın.</li>
	<li>Numuneyi 2.500 x g 'de 15 dakika santrifüjün. Gerekirse, plazmayı yeni bir tüpte pipet ve plazma örneklerini birkaç gün boyunca 4 °C ' de saklayın ...

<ol>
	<li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy:+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load.">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function.">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li><li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+perspective+on+human+polyomavirus+infection,+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation.">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li><li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy:+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome.">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region.">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li><li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus,+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12.">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li><li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients.">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li><li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants:+sequence+comparison+and+functional+analysis.">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li><li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology.">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li><li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression.">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li><li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate.">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li><li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression.">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li><li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia.">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).</li><li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland.">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li><li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals.">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li><li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy.">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li><li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+(FACS).">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li><li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation.">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li><li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens.">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li></ol>

Bu makalede, sık kullanılan bir yöntem, bkpyv kodlama olmayan denetim bölgesi (nccr) erken ve geç Organizatör etkinliği yönetilen analizi için olanak sağlar sunulmuştur. Nccr aktivite aynı anda ölçülebilir ve transfekte hücrelerin lizis gerekmez. Dahası, nispeten çok sayıda hücre analiz edilebilir ve floresan değerlerinin normalleştirilmesi için ek işaretçilerin eş transfeksiyonunu gerekli değildir.
Bu yöntemin kritik bir kısmı, klonlanmış nccr 'nin, hasta plazm...

Polyomaviruses küçük çift telli DNA bağımsız bir aile temsil (dsDNA) Simian virüsü 40 ile virüsler (BAZıLARıNDA SV40) bir prototip türü olarak. Primer enfeksiyon çoğunlukla çocukluk çağında oluşur, genellikle hastalık belirtileri olmadan devam ve genellikle bağışıklık yetkili konaklarında gizli enfeksiyonlara neden. BK-polyomavirus (BKPyV), renal tübüller hücrelerinde nefropatolojilere neden olmadan çoğunlukla devam eder, ancak böbrek nakli sonrasında bağışıklık-yetkinliğin bozulması durumunda virüs yeniden etkinleştirebilir ve şiddetli zararlar verebilir ve greft bozulması yüksek viremi ulaştığında fonksiyon (1 x 104 bkpyv DNA kopyaları/ml)1,2. Böbrek nakli alıcılarının yaklaşık% 10 ' unda, BK-polyomavirüsdür (bkpyv) ' ın yeniden aktivasyonu, renal allogreft arızaları yüksek riskiyle ilişkili% 80 ' a kadar olan polyomavirüsdür Associated nefropati (pyvan) ile sonuçlanır3,4 . Hiçbir onaylı antiviral ajanlar mevcut olduğundan, mevcut tedavi immünerbastırma azaltılması dayanmaktadır. İlginçtir, mTOR inhibitörleri bir antiviral etkiye sahip gibi görünüyor; Bu nedenle, immünpresif tedavisini mTOR bazlı immünerimoterapi ile değiştirmek, bkpyv viremi5,6,7' nin ilerlemesini önlemek için alternatif bir yaklaşım gösterebilir. Ancak, mTOR tabanlı antiviral mekanizması şu anda hala tamamen anlaşılır. Böylece potansiyel antiviral ajanların klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda etkisini ölçen Yöntemler gereklidir.
BKPyV 'in dairesel genomu, çoğaltmanın kökeni olarak hizmet veren ve erken ve geç faz mRNA transkriptinin ifadesini kullanan çift yönlü bir promotör olan bir kodlama olmayan kontrol bölgesini (NCCR) barındıran yaklaşık 5 KB 'den oluşur. Nccr-redüzenlemeler, silmeler ve çoğaltmalar ortaya çıktığı için patojenik bkpyv8 ' de bulunan ve pvan5,9, arketipsel (WT) bir karşılaştırma muzdarip hastalarda önemli ölçüde birikmiş yeniden düzenlenmiş (RR) NCCR-faaliyetler viral çoğaltıcı Fitness karakterize etmek yararlıdır.
Şekil 1' de özetlendiği gibi, bu protokol, bir muhabirin Plasmid5' den ifade edilen iki fluorophores tdtomato ve EGFP floresans ölçerek bkpyv nccr transkripsiyonel etkinliğini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemi açıklar, 9,10,11. Prosedür, potansiyel antiviral ajanların erken ve geç NCCR-aktivite ayrı5üzerinde etkisini analiz etmek için ızın veren bazılarında SV40 büyük T antijeni (LTag), varlığında gerçekleştirilir. Bu tahlil daha nccr aktivite ve WT-nccrs ile karşılaştırma üzerinde yeniden düzenlemeleri etkisini analiz5,9. Muhabir plazmid, her bir fluorophore açık okuma çerçevesinin bazılarında SV40 geç Poliadenilasyon sinyallerini, sırasıyla tdtomato ve EGFP için her iki transkriptin karşılaştırılabilir ve verimli bir şekilde işlenmesini sağlamak için harborlar. QRT-PCR tabanlı yöntemler5,12ile karşılaştırıldığında, bu FACS tabanlı yaklaşım, virüslü hücre kültürü için karmaşık ayıklama protokolleri olmadığından ve pahalı olmayan bir düşük maliyetli ve yüksek verimlilik uyumlu alternatifi temsil eder bağışıklık floresan boyama için antikorlar gereklidir. Ayrıca, tanımlanan bir miktar floresan hücre Akış sitometrisi aracılığıyla analiz edildiğimden, hücre döngüsü inhibe edici ajanların analizi de nicel bir şekilde mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:959px;" width="957">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">100 bp ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N3231</td>
			<td style="width:379px;">Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">2-log ladder</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">N0550</td>
			<td>Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Agar-Agar, Kobe I</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">AgeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Ampicillin Natriumsalz Cellpure</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">HP62.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Aqua ad iniectabilia</td>
			<td style="width:127px;">Bbraun</td>
			<td style="width:151px;">2351744</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSCanto&#8482; II</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DAPI</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:151px;">10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DFC450C camera module</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any camera can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DMIL LED microscope</td>
			<td style="width:127px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any fluorescence microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">DNA Blood Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">51104</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">E.coli DH5alpha Competent Cells</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">18258012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FBS Superior</td>
			<td style="width:127px;">MerckMillipore</td>
			<td style="width:151px;">50615</td>
			<td style="width:379px;">Any FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">FlowJo v10.5.3</td>
			<td style="width:127px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:379px;">Any flow cytometry software FBS can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Gel Loading Dye, Purple (6X)&#160;</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">B7024</td>
			<td>Any 6x loading dye can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">11268</td>
			<td>These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HERAcell&#174; 240i CO2 Incubator</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">HotStar PCR kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen</td>
			<td style="width:151px;">203203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Intas Gel documentation system</td>
			<td style="width:127px;">Intas</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Low Melt Agarose</td>
			<td style="width:127px;">Biozym</td>
			<td style="width:151px;">850081</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">31985070</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">pBKV (34-2)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:151px;">45025</td>
			<td>Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PBS</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td>
			<td style="width:127px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:151px;">discontinued product</td>
			<td style="width:379px;">Any thermocycler can be used</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td>
			<td style="width:127px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">#C1145</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PCR1 and PCR2 Primers</td>
			<td style="width:127px;">metabion</td>
			<td style="width:151px;">not applicable</td>
			<td>Desalted. Dilute to (10 &#181;M) with PCR grade water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">PenStrep (100x)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">15140-122</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Roti&#174;-GelStain</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">3865</td>
			<td>A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">SpeI-HF</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">R3133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">T4-DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB</td>
			<td style="width:151px;">M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">TransIT LT1</td>
			<td style="width:127px;">Mirus</td>
			<td style="width:151px;">MIR2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">Trypsin 0.05% - EDTA</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:151px;">25300-054</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:303px;">ZymoPURE II Plasmid Kit</td>
			<td style="width:127px;">Zymo</td>
			<td style="width:151px;">D4201</td>
			<td>can be substituted by any manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of bk-polyomavirus non-coding control region driven transcriptional activity via flow cytometry

BK-polyomavirus (BKPyV) gibi polyomaviruses, bağışıklık sistemini tehlikeye atılan hastalarda şiddetli patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antiviral Şu anda mevcut olmadığı için, potansiyel anti-virüs ajanların etkisini ölçme yöntemleri gereklidir. Burada, BKPyV kodlama olmayan kontrol bölgesinin (NCCR) erken ve geç organizatörü aktivitesinin analizine izin veren bir çift floresan muhabiri, potansiyel antiviral ilaçların tdTomato ve eGFP aracılığıyla viral gen ifadesinde etkisini ölçmek için inşa edildi Ifa -de. Buna ek olarak, bu protokolde, immünolojili renal nakledilen hastaların kan türeği DNA 'sından örnek olarak elde edilen bkpyv-nccr amplikonlar klonlayarak, nccr-redüzenlemeleri viral gen ifadesi üzerine etkisi tespit edilebilir. Hasta türevi amplicons klonlama sonrasında, HEK293T hücreler muhabiri-plazmids ile transferleştirilmiş ve potansiyel antiviral ajanlar ile tedavi edildi. Daha sonra hücreler, ortalama floresans yoğunlukları 72 h Post transfeksiyon ölçümü için FACS-analizine tabi tutulmuştur. Ayrıca potansiyel bir hücre döngüsü inhibe etkisi olan ilaçların analizini test etmek için, sadece transfekte ve böylece floresan hücreler kullanılır. Bu tahlil büyük T antijeni hücre ifade gerçekleştirildiği için, erken ve geç ifade etkisi karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilir.

Bu temsilci denemede, BK-polyomavirus kodlama olmayan kontrol bölgesi güdümlü transkripsiyon aktivitesi Akış sitometrisi ile ölçülmüştür. Ayrıca, BKPyV reaktivasyonu sonrasında hastaları tedavi etmek için kullanılabilecek bir mTOR inhibitörü, viral erken Gen ifadesinin inhibisyonu için test edildi. Bu amaçla, daha önce yayınlanan bir çift floresan-muhabir tahlil olarak kullanıldı5. Deneysel kurulumunun genel iş akışı şeması F...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü

Bu yazıda, tdTomato ve eGFP 'i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Bu protokolün genel amacı, akış sitometrisi yoluyla çift floresan hücreleri ölçerek BK-poliomavirüs kodlama dışı kontrol bölgesi nin transkripsiyonel aktivitesini ölçmektir. BK-poliomavirüs, özellikle böbrek nakli alıcılarında, bağışıklık sistemi zayıf hastalarda ciddi patolojilere neden olabilir. Ancak, son derece etkili antivirüs şu anda mevcut olmadığından, diğer bileşiklerin potansiyel anti-viral etkisini ölçen yöntemler gereklidir.Bu yöntem virologların kodlama yanlı kontrol bölgesi tarafından yönlendirilen BK-poliomavirüs transkripsiyonel aktivitesini etkileyen potansiyel anti-viral ajanların etkisini analiz etmelerini sağlar. Bu test daha arketipik kodlama dışı kontrol bölgeleri ile karşılaştırıldığında organizatör etkinliği üzerinde yeniden düzenlemelerin etkisini incelemek için izin verir. Çift floresan raporu ile viral organizatör aktivitesini incelemenin avantajı, erken ve geç gen ekspresyonunun karşılıklı bağımsız bir şekilde analiz edilebilmektedir.Ayrıca, sadece transfected ve floresan hücreler analiz edildiğinden, virüs stoklarının ve uzun süreli enfeksiyöz hücre kültürü deneylerinin zor perforasyonu gerekli değildir, ayrıca hücre canlılığını ve perforasyonunu azaltan ilaçlar incelenebilir. Bu protokol, Duisburg-Essen Üniversitesi tıp fakültesi etik komitesi tarafından onaylanan insan araştırma yönergelerini izler. İlk adım poliomavirüs DNA izolasyonu için kan örnekleri toplamaktır.EDTA satın alma tüpleri kan en az üç mililitre toplamak. Numuneyi 2, 500 G'de 15 dakika santrifüj edin ve plazmayı yeni bir tüpe pipetleyin. 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne 40 mikrolitre protein SK hazırlayın ve pipetleme ile 400 mikrolitre plazma ekleyin.Üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi DNA leke çıkarma kiti kullanarak DNA'yı izole edin. Toplam 50 mikrolitre hacimde A astar çiftini kullanarak pcr öncesi ana karışımı hazırlayın ve önceden izole edilmiş DNA'yı kullanın. PCR tüpleri içine ana karışımı 45 mikrolitre dağıtın.PCR tüpleri içine izole DNA beş mikrolitre ekleyin ve tablo üç gösterildiği gibi reaksiyon koşulları ile PCR çalıştırın. Denatürasyon annealing ve uzatma 35 döngüler halinde tekrarlayın. İç içe uygulama için, klonlama için kısıtlama sitelerini barındıran Astar çifti B'yi kullanın.10 mikrolitre PCR ürününün altı kat jel yükleme boyasının iki mikrolitresini karıştırın. % 1.5 agarose jel karışımı 10 mikrolitre yük ve 60 miliamper de 30 dakika boyunca jel çalıştırın. Uygun bir UV dokümantasyon sistemi kullanarak jel görselleştirin.PCR amplicon'ları, üreticinin talimatlarına uygun bir PCR arıtma kiti kullanarak arındırın. 37 santigrat derecede iki saat boyunca gösterge kısıtlama enzimleri ile saflaştırılmış amplikonss sindirin. Sindirilmiş amplicons arındırmak için arıtma adımlarını tekrarlayın.Buna paralel olarak, aynı zamanda plazmid omurgasını sindirmek. Sindirilmiş plazmid omurgasını %0,8 düşük monte agarose jel üzerinde analiz edin. Jeli 40 miliamperden daha yüksek bir akımda çalıştırmayın.Uzun dalga UV ışığı kullanarak DNA parçalarını görselleştirin ve temiz bir neşter kullanarak bükülmüş omurgayı kesin. DNA hasarlarını önlemek için uzun UV ışınlarına maruz kalma sürelerinden kaçının. Yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp içine flomel jel parçası parçası için Çit.Jel parçayı eritmek ve her iki dakikada bir nazik girdap ile karıştırmak için düşük modda agarose parçasını 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtın. Erimiş jel doğrudan ligasyon için kullanılabilir. Ligate omurga ve sindirilmiş amplicon t4 DNA ligaz kullanarak gecede 16 santigrat derece.Standart klonlama işleminden sonra plazma DNA'sını izole edin. Pozitif klonları kontrol etmek ve % 1 agarose jel üzerinde sindirilmiş parçaları görselleştirmek için restriksiyon enzim sindirim gerçekleştirin. Tohum 100, 000 HEK293T hücreleri 12 kuyu plaka sıc24 saat önce transfeksiyon ve kuluçka gece leme 37 santigrat derece, transfeksiyon sırasında aktif çoğalma korumak.Hücreler transfeksiyonda yaklaşık %80 birleşme de olmalıdır. Steril tüpe 250 mikrolitre azaltılmış serum media yerleştirin ve bildirilen her plazma DNA'sının bir mikrogramını ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. DNA karışımına transfeksiyon reaktifinin üç mikrolitresini ekleyin ve pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve 22 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.Karışımı ekleyin, damla-bilge kuyuya ve yavaşça kuyuya dağıtmak. Dört saat sonra, test maddeleri ve çözücü kontrolü içeren taze orta ile supernatant değiştirin. Bu örnekte, mTOR inhibitörleri INK-128 ve rapamisin kullanılmıştır.Analiz ene kadar 37 derecede kuluçkaya yat. Floresan mikroskobu altında kırmızı ve yeşil floresan için hücreleri kontrol edin. Kırmızı ve yeşil floresan sisi erken ve geç BK-poliomavirüs gen ekspresyonuna tekabül eder.Transfeksiyondan 72 saat sonra, supernatant'ı dikkatlice arzula. Bir mililitre soğuk PBS ile hücreleri iki kez yıkayın. Yavaşça 500 mikrolitre trypsin ekleyin ve hücrelerin erken ayrılmasını önlemek için biraz plaka açın.Bu adım hücre doublets önlemek için önemlidir. Ekolarak, tripsin doğrudan aynı pipet ucu ile kaldırılır. Hücreleri en az beş dakika 37 derecede kuluçkaya yatırın.Tripsin S hücrelerini %3 FCS içeren bir mililitre PBS içeren yeniden askıya alın ve önceden etiketlenmiş FACS tüplerde süspansiyonu aktarın. FACS analizinden önce mililitre başına bir mikrogram konsantrasyonunda DAPI ekleyin. Akış sitometrekullanarak hücreleri analiz edin.Her örnek için en az 10.000 canlı hücreyi ölçün. Doğru sonuçlar elde etmek için kırmızı ve yeşil sinyalleri ayırt etmek için ilk tazminat esastır. Kodlama olmayan kontrol naibi, klonlama için kısıtlama alanlarını barındıran iç astar çifti kullanılarak iç içe açılan bir PCR protokolü kullanılarak güçlendirilmiştir.Amplikon doğrulama agarose jel elektroforezi ile gerçekleştirilirken, arketipik NCCR dizilerinden elde edilen amplikonslar jeldeki homojen boyut dağılımında, yeniden düzenlenmiş NCCR'lardan elde edilenler ise boyutları farklıydı. NCCR içeren pozitif klonların seçimi kısıtlama analizi ile doğrulandı. Küçük spacer bölge pozitif klonlar gösteren büyük NCCR parçaları ile değiştirildi.Doğrulanmış klonlardan izole edilen plazmid DNA'sı pyrosequencing için gönderildi. Bu örnekte, P bloğundaki silme ve O bloğundaki ikame algılandı. HEK293T hücreleri rapor edilebilir yapıya saygı ile geçici olarak transekse edildi ve NCCR aktivitesi floresan mikroskopisi ile izlendi.Kırmızı ve yeşil floresanlar sırasıyla erken ve geç BK-poliomavirüs gen ekspresyonuna karşılık gelmektedir. İkinci örnek nispeten güçlü bir erken ama orta geç gen ekspresyonu varken ilk NCCR güçlü bir geç gen ekspresyonu gösterdi. DAPI negatif hücreleri geçitli ve tdTomato karşı eGFP gösteren bir nokta arsa oluşturuldu.Analize negatif olduğu kadar tdTomato veya eGFP pozitif olan numuneler de analize dahil edildi. Ortalama floresan yoğunlukları her test klon elde edildi. Bu örnekte, çift mTOR inhibitörü INK128 ile yapılan tedavi tdTomato MFI'yi önemli ölçüde azaltmıştır, bu da erken ekspresyonun inhibe edildiği anlamına gelir.Bu yöntem transkripsiyonel aktivite yoluyla BK-poliomavirüs tespit etmek için şu anda kullanılan ve diğer bileşiklerin belirlenmesine olanak sağlar. Erken gen ekspresyonunda, bu kesinlikle viral ima belirler. İnhibitör damlaları BK-poliomavirüs reaktivasyonu durumunda immünazasyonlu hastalar için ajan olarak kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Klasik Hodgkin Lenfomalı Reed-Sternberg Hücrelerinin Akış-Sıralama ve Ekstraksiyon Sıralaması

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Keskin nişancı-Cas9 CRISPR-Cas9 hedef olarak faaliyet yönlendirilmiş evrim yoluyla kaybı olmadan hedef kapalı etkilerini en aza indirmek için kullanma

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Aneuploidi için Preimplantasyon Genetik Test için Yarı iletken Sıralama

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...