Name: generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث بمنح من مؤسسه مايكل جي فوكس ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NS099416) ومعهد ويستون الدماغ.

<ol>
	<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice.">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration.">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li><li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration.">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration.">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Over+Quantity:+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson's+Disease.">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells.">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death.">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates.">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li><li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies.">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies.">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li><li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson's+disease.">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li><li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain.">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).</li><li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson's+Disease+in+Rodents.">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li><li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson's+disease.">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li><li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein,+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces.">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788 (2018).</li><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li><li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation.">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li><li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons.">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li></ol>

جوزيف باترسون ، كلفن لوك ، وكاريل Sortwell تشارك حاليا في الترتيبات التعاقدية مع مؤسسه مايكل j. فوكس لمراقبه الجودة المواد α-syn التي ولدتها بروتيتوس ، وشركه Coauthor نيكول بولينسكي ، هو موظف من مايكل j. فوكس المؤسسة ، التي تعاقدت مع بروتيتوس ، وشركه لإنتاج α-syn مونومر. المؤلفون المشاركون ميغان دافي ، لورا فولبيكلي-دالي ، ونيكولاس كنعان ليس لديهم شيء للكشف عنه.

إنتاج α-syn PFFs قادره علي بذر الخلايا العصبية والتي تؤدي إلى الشوائب مثل الجسم لوي يعتمد علي عوامل متعددة وخطوات. والعامل الحاسم هو ان مونومرات المستخدمة لتوليد ألياف الليفية تحتاج إلى ان تصاغ خصيصا لالفيسيليشن4،9،14،15. إذا لم يتم وضع مونومرات لليفي ، قد لا تشكل الفيفيلز أو الفيفيلز التي لا تشكل قد لا تنتج α-syn علم الامراض. المثل ، فان العازلة التي مونومرات هي أيضا في التاثير علي ألياف الليفية. علي هذا النحو ، للحصول علي أفضل النتائج ، يجب ان يكون تركيز الملح حوالي 100 مم كلوريد الصوديوم ودرجه الحموضة بين 7.0 و 7.3. الخطوة الاوليه التي تقدم التغير هي الطريقة التي يتم بها تحديد محتوي البروتين الاولي ، مع القياس في A280 من المرجح ان تنتج نتائج أكثر دقه التالي هي الطريقة المفضلة. التباين في تركيز البروتين يمكن ان يقلل من فعاليه عمليه الفيسيليشن ، فضلا عن تغيير تركيز PFF المفترضة المستخدمة في التجارب. كلاهما يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في كفاءه البذر والتباين دفعه بين التجارب.
ستؤكد الخطوات الاوليه لمراقبه الجودة السمات الحاسمة لل PFFs ، علي وجه التحديد ان لديهم التشكيل الليفي (المجهر الكترون) ، وتحتوي علي هياكل اميلويد (ثيوفلافين T الفحص) ، وهي التكوير (الترسيب المقايسة). من المهم ان نلاحظ ان نتائج الفحص ثيوفلافين T سوف تتقلب مع الوقت وليست مقياسا مباشرا لكميه الهياكل اميلويد الحاضر ، بدلا من ذلك ، يجب ان تستخدم المقايسة ثيوفلافين T فقط كمؤشر علي وجود هياكل اميلويد داخل العينة. وعاده ما يستخدم ثيوفلافين T في اختبارات في المختبر ، مثل الفحص المذكور أعلاه لإظهار الفيفيلز تحتوي علي هياكل اميلويد. بدلا من ذلك ، يتم استخدام ثيوفلافين S في الانسجه للكشف عن الهياكل اميلويد ، كما هو مبين في الشكل 7. في ما يتعلق ب ال ترسيب فحص, يبدي النتيجات فقط ان ال [بفس] يكون أسست غالبا في الكسر [بليتبل]. كما يتم تشغيل العينات في ظروف التعتيم ، وهي فرقه واحده بارزه من حوالي 14 كده ، وحجم α-syn مونومرات ، موجودة علي الهلام. وهذا علي عكس النطاقات المتعددة الموجودة في الأوزان الجزيئية العالية التي من المتوقع مع PFFs إذا تم استخدام هلام الأصلي أو غير ديكاترينغ. وأخيرا ، فان النجاح في اجتياز جميع هذه الخطوات الاوليه لمراقبه الجودة لا يضمن النشاط البذر α-syn التضمين. ولهذا السبب ، ينبغي استخدام تجارب استزراع الخلايا أو مجموعه صغيره من الحيوانية المحقونة جراحيا لاختبار فعاليه ال PFFs قبل استخدامها في تجارب أكبر.
صوتنه هو خطوه حاسمه في عمليه وسوف تختلف المعلمات اعتمادا علي نموذج sonicator المستخدمة. يجب تطبيق المعلمات صوتنه والتحقق منها لإظهار ان شظايا PFF قصيرة قد تم إنتاجها. وقد تحمل حجم الفيريل علي البذر ، مع أقصر البذر الفيفيلز أكثر كفاءه. علي الرغم من أقصر البذور الفيفيلز أكثر كفاءه ، وهذا التاثير الهضاب وطول pff الأمثل هو تقريبا 50 nm4،18. ومن المهم أيضا عدم الإفراط في النظر في العينات وفضح الحرارة المفرطة ، لان هذا قد يقلل من كفاءه البذر. وينبغي اختبار هذه pffs سونيكاتيد لفعالية في ثقافة الخلايا الصغيرة أو في التجارب المجرية قبل استخدامها في التجارب علي نطاق أوسع. كما دورات سونيكيشن مختلفه لديها القدرة علي إدخال التباين, وينبغي التخطيط لمجموعات العلاج التجريبي وفقا لذلك.
عند تقديم pffs في فيفو ، وتوطين موقع (ق) الحقن والمبلغ الإجمالي pffs المستخدمة يمكن ان تؤثر علي عدد من الخلايا العصبية التي سوف تتطور الشوائب ، فضلا عن مدي الضمور العصبي7،14. الإحداثيات في البروتوكول توفر مكانا للبدء ، ولكن ينبغي اختبارها داخل المختبر لضمان المنطقة المستهدفة المرجوة يطور α-syn علم الامراض قبل استخدامها في التجارب علي نطاق واسع. إذا رغبت في ذلك ، تتبع صبغ أو الخرز الفلورسنت يمكن استخدامها كوسيلة لاختبار الاستهداف الإقليمي قبل استخدام PFFs. يختلف مقدار pffs المستخدمة في الجسم المجري بين المجموعات ، مع معظم المجموعات باستخدام ما مجموعه بين 5 إلى 20 ميكروغرام من pffs في واحد أو مقسمه بين اثنين من مواقع الحقن1،2،3،4،5 , 6 , 7 , 14. كما ان عدد من مواقع الحقن ، وموقع مواقع الحقن ، وكميه من الحقن المحقونة يمكن ان تؤثر علي نتائج وتطور اعتلال النواة ، وينبغي ان توصف نتائج المصب من المعلمات المستخدمة قبل استخدام النموذج اختبار التدخلات المحتملة أو فحص السمات الزمنيه للنموذج.
عند اختيار نموذج لاستخدامه لاختبار التداوي أو دراسة تطور المرض ، يجب اختيار النموذج المستخدم للاجابه علي أفضل الاسئله المطروحة. ليس كل النماذج سوف تمتلك بعض ملامح المرض من PD ، أو تقديم الإطار الزمني اللازم لاختبار التدخلات المحتملة. ويلخص نموذج PFF السمات الرئيسية لل PD ، مثل علم الامراض α-syn والضمور العصبي ، ويمكن ان يؤدي إلى إعاقات حركيه متواضعة. يقدم النموذج دوره زمنيه يمكن التنبؤ بها ومطوله ، حيث تشكل الشوائب أشهر قبل الضمور العصبي. وهذا يسمح للباحثين بفحص واستغلال المراحل المختلفة خلال التطور المطول لاعتلال النواة. ومن المتوقع ان يكون الاستخدام الحالي والمستقبلي للنموذج العام مفيدا في دراسة تطور المرض وتطور العلاجات الجديدة.

مرض باركنسون (PD) ويتميز في المقام الأول بعد الوفاة من قبل اثنين من السمات المرضية الرئيسية: علي نطاق واسع والتقدمي الفا synuclein (α-syn) علم الامراض ، وانحطاط نيجروسترياتال. بعد الحقن في الفئران البرية أو الفئران ، α-syn ألياف الليفية بريفورميد (pffs) الحث علي التراكم التدريجي لل α-syn المرضية ، والتي يمكن ان تؤدي إلى انحطاط طويل الأمد من المكونات السوداء التي الخلايا العصبية الدوبامين (snpc) علي مدي العديد من أشهر ، فضلا عن العجز حسي1،2،3،4،5،6. وتتعرض الخلايا العصبية للفينيات α-syn ، اما عن طريق الحقن المباشر داخل المخ أو أضافه إلى وسائل الاعلام من الخلايا العصبية المستزرعة. عندما يتم أخذها في الخلايا العصبية ، والقانون pffs إلى "البذور" تشكيل الشوائب من خلال القولبة ، وتراكم α-syn الذاتية في الشوائب الفوسفروتيلاتيد1،7،8، 9-الآن تتضمن الشوائب خصائص متشابهة لأجساد لوي: تحتوي علي α-syn الفوسفارلاتيد في سيرين 129 (بسينون) ، اوبيكويتين ، و p62 ؛ تمتلك الهياكل الرباعية اميلويد كما هو مبين مع تلطيخ ثيوفلافين الايجابيه ؛ ومقاومه ل بروتيداز ك الهضم1،3،5،7،8،9،10،11، 12-الآن يؤدي التعرض pff إلى تكوين α-syn في المرحلة الابتدائية وبعض الخلايا العصبية الخلده في الثقافة ، فضلا عن الفئران والجرذان والرئيسيات غير البشرية في فيفو1،2،3،4، 5،6،7،8،9،13. من المهم ان نلاحظ ان الخلايا العصبية الدقيقة لن تؤدي إلى تكوين الفا syn في جميع نماذج ثقافة الخلية وبعض الخلايا العصبية مثقف سوف البذور أفضل من غيرها.
ومن السمات الهامه الأخرى للنموذج المجري α-syn PFF المراحل المرضية المتسلسلة المتميزة التي تظهر علي مدي عده أشهر. في القوارض, بعد حقن إينتراسترياتال, الفا-syn التضمين تشكيل قمم عموما داخل SNpc والعديد من المناطق القشرية في غضون 1-2 أشهر. ويلي هذا التراكم الذروة بواسطة الضمور ال≈ 2-4 أشهر في وقت لاحق1,3,5. هذه المراحل المرضية متميزة توفر للباحثين المنصة التي لدراسة وتطوير الاستراتيجيات التي 1) إنقاص α-syn التجميع ، 2) واضحة شكلت بالفعل الشوائب α-syn ، و/أو 3) منع الضمور العصبي اللاحقة. نموذج PFF يقدم مزايا متميزة وعيوب بالمقارنة مع السمية العصبية ، المعدلة وراثيا ، وناقلات الفيروسية توسط α-syn نماذج التعبير الفوقي كما سبق مراجعتها6. وينبغي تحديد النموذج أو النهج الذي سيتخذه النموذج الأنسب الذي يناسب السؤال الذي يطرحه المحققون.
علي الرغم من ان نموذج PFF قد استخدمت بنجاح من قبل العديد من المختبرات ، لا تزال هناك مجموعات التي شهدت عدم الاتساق مع توليد الفيفيلز وإنتاج متسقة α-syn الامراض14. أمثله من التناقضات تتراوح بين التي تنتج القليل أو لا الامراض α-syn ، دفعه لكفاءة البذر دفعه ، وحتى فشل الفيفيلز لتشكيل. التالي ، فان توحيد الجيل α-syn PFF وفي تطبيق الجسم الحيوي أمر بالغ الاهميه من أجل السماح لتفسيرات دقيقه فيما يتعلق بتاثير التدخلات العلاجية الجديدة. يحدد البروتوكول التالي الخطوات المطلوبة لتوليد الوحدات الخاصة من مونومرات α-syn ، ومراقبه الجودة في المختبر من PFFs شكلت مره واحده ، سونيكيشن وقياس PFFs قبل الاستخدام ، واقتراحات لتسهيل ناجحه في حقن الجسم الاصطناعي من في الفئران أو الفئران.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >1x Dulbecco's phosphate buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB184674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB15530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bicinchonic acid</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Copper sulfate</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >2231000574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Eppendorf ThermoTop heated lid</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formvar/Carbon coated electron microscopy grids</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >FCF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length)</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >22-326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass needle puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hamilton syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm M</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >25530015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica 3.2 mm tip</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica Q125 sonicator</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thioflavin S</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >T1892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Thioflavin T</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >596200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td>
			<td >Genscript</td>
			<td >L00350C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uranyl acetate</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo

استخدام في الجسم الفيفو الفا synuclein بريفورماين (α-syn PFF) نموذج من اعتلال النواة تكتسب شعبيه بين الباحثين تهدف إلى نموذج مرض باركنسون داء النيونوستريفاتال وانحطاط القرنية. توحيد الجيل α-syn PFF وفي تطبيق الجسم الحيوي أمر بالغ الاهميه من أجل ضمان متسقة وقويه α syn الامراض. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد ألياف الليفية من مونواريك α-syn ، وخطوات التحكم في الجودة بعد الحقن ، والمعلمات المقترحة للحقن الجراحي العصبي الناجح لل α-syn الغدد الصم في الفئران أو الفئران. بدءا من موحودي α-syn ، يحدث الليفي علي مدي فتره حضانة لمده 7 أيام اثناء الاهتزاز في ظروف العازلة الأمثل ، والتركيز ، ودرجه الحرارة. يتم تقييم التحكم في الجودة بعد التشكيل الليفي من خلال وجود ألياف الليفية القابلة للتكوير عن طريق فحص الترسب ، وتكوين اميلويد في الفيفيلز مع فحص ثيوفلافين T ، والتصور المجهري الكترون للفيفيلز. في حين ان التحقق من صحة ناجحه باستخدام هذه المقايسات ضروري للنجاح ، فانها ليست كافيه لضمان سيتم البذور الشوائب α-syn في الخلايا العصبية ، كما ينبغي اختبار هذا النشاط التجميع من كل دفعه PFFS في ثقافة الخلية أو في الأفواج الحيوانية الرائدة. قبل الاستخدام ، يجب ان تكون الفحوصات بالرنين الضوئي تحت ظروف قياسيه بدقه ، تليها الفحص باستخدام المجهر الكتروني أو تشتت الضوء الديناميكي لتاكيد أطوال الفيريل ضمن نطاق الحجم الأمثل ، مع متوسط طول 50 نانومتر. ويمكن بعد ذلك أضافه PFFs إلى وسائل الاعلام الثقافة الخلية أو استخدامها في الحيوانية. علم الامراض التي يمكن كشفها عن طريق المناعية ل α-syn (بسينون ؛ سيرين 129) هو واضح أيام أو أسابيع في وقت لاحق في ثقافة الخلية ونماذج القوارض ، علي التوالي.

يبدا توليد الفيفيلز من مونومرات α-syn بتحديد تركيز مونومرات. ويمكن استخدام كل من فحص BCA وقياس الامتصاص عند 280 نانومتر (A280) لقياس محتوي البروتين ؛ نتائج فحص BCA ، ومع ذلك ، اقترح تركيز اعلي من الأسلوب A280. وكانت المشتقات من الماوس α-syn مونومير قيمه BCA 14.05 ± 0.22 و A280 من 8.05 ± 0.03 ميكروغرام/μL (الشكل 1). المثل ، فان الشركات المشتقة من الإنسان α-syn مونومر يبدو أيضا انها في تركيز اعلي ، مع قيمه BCA 12.95 ± 0.38 و A280 من 7.83 ± 0.05 ميكروغرام/μL (الشكل 1). قياسات A280 هي محدده ل α-syn استنادا إلى ادراج معاملات الانقراض واستخدمت هذه النتائج لتمييع مونومرات قبل الحضانة 7 أيام.
قبل الحضانة ، كان السائل الذي يحتوي علي مونومرات α-syn واضحا ، ولكن يجب ان يظهر عكرا بعد تشكيل الفيريل. وأكد الفحص مع المجهر الكترون انتقال وجود الفيفيلز طويلة ، وقياس 10-20 nm واسعه (الشكل 4). المقارنة ، كانت مونومرات α-syn بالبالكاد مرئية مع عدم وجود شكل ملحوظ واضح (الشكل 4). مع التاكيد البصري للهياكل لييفي ، والتشكيل اميلويد من ألياف الليفية هو الميزة التالية لل PFFs التي ينبغي ان تؤكد باستخدام ثيوفلافين T المقايسة. ثيوفلافين T المعروضات المعززة فلوري عندما ملزمه اميلويد. التالي ، تشير زيادة اشاره الفلورسنت من العينات وجود اميلويد. علي سبيل المثال ، أنتجت ثيوفلافين في dPBS اشاره من 3,287 ± 580 وحدات الفلورسنت النسبية (RFU) ، والماوس α-syn مونومر أنتجت اشاره من 4,174 ± 158 RFU ، وأنتجت الماوس PFFs اشاره من 59,754 ± 6,224 RFU (الشكل 5). في المقارنة ، أنتجت الإنسان α-syn مونومر اشاره مماثله من 4,158 ± 105 RFU إلى الماوس مونومر ، وأنتجت PFFs الإنسان اشاره اعلي من 1,235,967 ± 113,747 RFU بالمقارنة مع الماوس PFFs (الشكل 5). لتقييم وجود ألياف الليفية القابلة للبلان ، تم اجراء فحص الترسيب. الفيفيلز سوف بيليه مع طرد. في كل من الماوس وعينات pff البشرية ، يجب ان يكون كسر سوبرناتانت المزيد من البروتين في بيليه من ماده طافي (الشكل 6). وعلي النقيض من ذلك ، كانت غالبيه البروتين من الماوس والمونومرات البشرية موجودة في supernatant ، مع القليل من الحاضر في بيليه (الشكل 6). مع الموجودة بشكل واضح بواسطة المجهر الكترون ، والهياكل اميلويد الحالية ، والتكوير الليفي ، مرت PFFs جميع في خطوات مراقبه الجودة في المختبر.
وكانت كل من الماوس والإنسان pffs سونيكاتيد لإنتاج بفس من أطوال مناسبه لبذر α-syn الشوائب4,18. تم تخفيف PFFs إلى التركيز المطلوب من 4 ميكروغرام/μL و sonicated. قبل الجراحة مباشره ، تم تصوير 25 من ألياف الليفية التمثيلية بواسطة المجهر الكتروني وقياسها للتحقق من حجم الفيريل. الماوس سونيكاتيد قياس 48.8 ± 3.1 nm ، في حين ان الإنسان pffs يقاس 52.1 ± 4.4 nm في الطول ؛ كان [بفس] من كلا أنواع لذلك الطول مناسبه (50 [نم] أو اقل) ان يحث [بذر كتيفيتي]. كشفت دراسة أكثر شمولا لحوالي 500 ألياف الليفية متوسط طول وطول توزيع الفيفيلز الماوس سونيكاتيد. وكان متوسط طول 44.4 ± 0.6 nm ، مع 86.6 ٪ من PFFs قياس 60 نانومتر أو اقل (الشكل 4). المقارنة ، بلغ متوسط ال55.9 البشرية ± 1.1 نانومتر بنسبه 69.6 في المائة من المؤشرات التي تقيس 60 نانومتر أو اقل (الشكل 4).
بعد حقن إينتراسترياتال من الفئران الفارهة في الجرذان كما هو موضح سابقا3,5, تم تجهيز سلسله من أقسام الانسجه في 2 أشهر بعد الجراحة, عندما يتم التعرف علي عدد من تضمين الخلايا العصبية التي تحتوي علي الذروة في SNpc ، لتاكيد الشوائب α-syn فوسفوفورلاتيد5. تضمين الخلايا العصبية التي تحمل ، كما هو مبين من مناعي تلطيخ ل بسينون (الأجسام المضادة في جدول المواد) موجودة داخل snpc (الشكل 7) ، فضلا عن مناطق أخرى في جميع انحاء الدماغ التي inعصبيه الشريطية (الامامي نواه حاسة الشم ، المحرك ، التخثر ، الكمثري ، القلفة ، الحسية الجسدية ، entorhinal ، والرؤوس المعزولة ، اللوزة ، الشريطية)1،3،4،5،19. هذه الشوائب تقاسم خصائص مماثله مع الهيئات لوي ، مثل ملزمه ثيوفلافين S ، ومقاومه من إجمالي α-syn إلى بروتينيه K (الشكل 7) ، كما هو مبين من قبل تلطيخ مناعي (الأجسام المضادة و بروتيداز k في جدول المواد) . تاكيد البذر داخل الدماغ يشير إلى انه قد تم تمرير السيطرة علي الجودة في الجسم الآخر ، والارصفه من pffs المجمدة سابقا وحفظها من نفس الدفعة قد تكون سونيكاتيد تحت معلمات متطابقة ، مع أطوال المصادق عليها ، في تجارب أكبر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> الشكل 1 . طرق لتوليد الحبوب α-syn. الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لإنتاج الفيفيلز من مونومرات α-syn. مونومرات هي طرد لمده 10 دقيقه (15,000 x g، في 4 °c). يتم نقل supernatant إلى أنبوب نظيف ويتم تحديد تركيز البروتين اما عن طريق الامتصاص في 280 نانومتر ، أو فحص BCA. يظهر الرسم البياني التركيزات من مونومرات α-syn البشرية والفاره. تشير الاعمده إلى وسائل المجموعة ، وتمثل أشرطه الخطا الخطا القياسي ± 1 لهذا المتوسط. بعد تحديد تركيز البروتين ، يتم تخفيف مونومرات α-syn ، لفتره وجيزة فورتيكسد وحضنت ل 37 درجه مئوية لمده 7 أيام ، في حين تهتز علي خلاط المداري تعيين في 1,000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> الشكل 2 . طرق تلطيخ لنقل المجهر الكترون. رسم تخطيطي لتلطيخ السلبية لمجهر الكترون. ا) الصور التي تصور شبكات عينه المجهر الكترون. الشبكة لديها الجانب مملة أو الخفيفة والجانب لامعه أو مظلمة. الجانب لامعه/الظلام هو المغلفة مع فيلم دعم formvar/الكربون. ب) توضيح الاجراء تلطيخ. يتم تعويم الشبكة لامعه/الجانب المظلم لأسفل علي القطرة الاولي من ddH2س لمده دقيقه واحده والفائض هو الأشرار بعيدا مع ورقه فلتر. وتتكرر هذه العملية مع القطرة الثانية من ddH2o ، المخففة pffs أو مونومرات ، وقطرين من خلات اليورانيل ، وقطرين اضافيه من ddh2O. قد يتم تخزين الشبكات في مربع الشبكة حتى الذين يعانون من الوهن. شريط مقياس = 3 ملم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> الشكل 3 . الجمعية من المحاقن الزجاج المخصصة ابره. رسم تخطيطي للخطوات المطلوبة لتجميع ابره الزجاج المرفقة المحاقن. يتم سحب الأنابيب الشعرية الزجاجية السيليكون وقطع في الوسط لإنتاج الابر الزجاجية. ويستخدم يتقلص التفاف الأنابيب لاعداد ابره معدنيه وتشكيل ختم الداخلية عندما يتم انزلق ابره الزجاج علي ابره معدنيه. يتم أضافه طبقتين إضافيتين من أنابيب اللف اليتقلص التي تتداخل مع قاعده الابره الزجاجية والابره المعدنية علي التوالي ويتم تطبيق الحرارة لتامين الابره الزجاجية وتشكل ختم محكم الغلق بالماء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> الشكل 4 . التصور من مونومرات α-syn و α-syn الفيفيلز عن طريق المجهر الكترون الإرسال. الرسوم البيانية التمثيلية لمونومرات α-syn وألياف الليفية. اللوحات العلوية: الماوس والإنسان α-syn مونومر. لوحات الأوسط: الماوس طول كامل والإنسان α-syn PFFs. اللوحات السفلية: الماوس والإنسان α-syn PFFs بعد سونيكيشن. الرسم البياني السفلي: توزيع الماوس الرنان وأطوال الإنسان α-syn PFF. شريط مقياس = 500 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> الشكل 5 . تاكيد من [اميلويد] بني ب ثيوفلافين [ت] فحص. قياس اشاره الفلورسنت من الماوس والإنسان α-syn مونومر وعينات PFF. اليسار: النتائج من الماوس α-syn مونومرات و α-syn PFFs. الحق: النتائج من مونومرات α-syn الإنسان و α-syn PFFs. يتم عرض عنصر تحكم سالب dPBS في كل رسم بياني. ويتم التعبير عن جميع القياسات كوحدات فلورية نسبيه (RFU). تشير الاعمده إلى وسائل المجموعة ، وتمثل أشرطه الخطا الخطا القياسي ± 1 لهذا المتوسط. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> الشكل 6 . فحص الترسيب للحصول علي الصور من الهلام الملون كوماسي. وتبلغ الفرق المعروضة حوالي 14 كيلو ده استنادا إلى سلم البروتين. اليسار: الماوس مونومر و PFFs. الحق: مونومرات البشرية و PFFs. بالنسبة لجميع عينات المونومر و pff ، يتم عرض البيليه المعاد تعليقه (P) و ماده طافي (S). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> الشكل 7 . ملامح من الشوائب في نموذج الفئران تاكيد α-syn الامراض. الرسومات البيانية التمثيلية من العناصر السوداء التي في 2 أشهر بعد الحقن. اليسار: الخلايا العصبية التي تحتوي علي بسينون والملطخة مع البنفسج كريريل. الأوسط: ثيوفلافين S الخلايا العصبية الايجابيه. الحق: α-syn التي تحتوي علي شوائب مقاومه للبروتين K. شريط مقياس = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو

والهدف من هذه المادة هو الخطوط العريضة للخطوات اللازمة لتوليد الفيفيلز من مونوميريك الفا-synuclein ، ومراقبه الجودة اللاحقة ، واستخدام ألياف الليفية التي تم تشكيلها في الجسم المجري.

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

يتم استخدام نموذج ألفا سينوكلين Preformed فيبريل من قبل مختبرات في جميع أنحاء العالم لدراسة synucleinopathies. على الرغم من أن النموذج قد استخدمت بنجاح من قبل العديد من المختبرات، شهدت بعض المجموعات التناقضات توليد الفيبريلس وإنتاج متسقة ألفا-سينوكلين علم الأمراض. نأمل أن هذا البروتوكول، الذي يفصل جيل الفيبريلس من مونومرات ألفا سينوكلين واستخدام الفيبريات شكلت مسبقا في الجسم الحي، يمكن الإجابة على الأسئلة التي لدى الباحثين حول استخدام النموذج.يقوم نموذج الفيبري المشبّل من طراز ألفا-سينوكلين بتلخيص الملامح الرئيسية لمرض باركنسون، مثل أمراض ألفا سينوكلين والتنكس العصبي. وقد تبين أنه يؤدي إلى ضعفات حركية متواضعة في بعض النماذج الحيوانية. تشكيل الادراج التي تحتوي على الفوسفور ألفا سينوكلين وإطالة الوقت دورة نحو التنكس العصبي يقدم للباحثين مراحل مختلفة في جميع مراحل تطور اعتلال synucleino، لدراسة واستهداف للتدخلات العلاجية المحتملة.مما يدل على إعداد الإبر الزجاج المخصص، هو فني مختبر لدينا، كريستوفر كيمب. لبدء هذا الإجراء، ذوبان أحادية ألفا سينوكلين على الجليد. إعادة تعليق مونومرات المذابة عن طريق الخفقان بلطف على الأنبوب.وطاردة مركزية عند 15000 غرام و أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ثم، نقل فائقة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل نظيفة وتسجيل الكمية المنقولة. تخفيف مونومرات مع 1x dPBS إلى تركيز نهائي من 5 ملغ لكل مل.دوامة لفترة وجيزة لخلط، وطاردة مركزية لفترة وجيزة لجمع كل من السائل في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك، استخدم فيلم لاصق لتأمين غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير المغلق. ضع الأنبوب في خلاط حراري مداري مع غطاء لمدة سبعة أيام عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة.في نهاية سبعة أيام ، يجب أن تظهر محتويات الأنبوب عكرًا. أولاً، دون جميع معدات الحماية الشخصية اللازمة بما في ذلك القفازات، ومعطف مختبر، ودرع الوجه. ثم، في غطاء لثقافة الخلية، نعلق على مسبار قطره 3.2 ملم إلى المحول.تعيين sonicators السعة إلى 30 ٪ والنبض إلى ثانية واحدة على وأخرى قبالة والوقت إلى دقيقة واحدة. ذوبان في fibrils في درجة حرارة الغرفة، وبينما لا يزال في غطاء محرك السيارة الثقافة، وتمييع فيبريلس مع dPBS العقيمة. المقبل، وتخميد الأنسجة المختبرية مع 70٪ الإيثانول واستخدام هذا لمسح التحقيق من sonicator لتنظيفه.غمر طرف المسبار في الماء المزدوج والنبض 10 مرات لتنظيف المسبار أكثر. بعد هذا، مسح مسبار الجافة مع نسيج المختبر. ضع طرف المسبار النظيف في أنبوب الفيبريلات المخففة ووضع الطرف في الجزء السفلي من الأنبوب.سونيكات في fibrils المخفف باستخدام المعلمات التي سبق تعيينها أثناء تحريك المسبار صعودا وهبوطا خلال كل نبضة لضمان أن جميع من fibrils في السائل هي sonicated. بعد سونيكيشن، لفترة وجيزة الطرد المركزي لثانية واحدة في 2، 000 غرام لجمع كل السائل من الجانبين من الأنبوب. غمر طرف المسبار في 1٪ من SDS والنبض 10 مرات لتنظيف المسبار.ثم، إزالة طرف من SDS، وغمره في الماء المقطر مزدوجة، والنبض 10 مرات. امسح المسبار بأنسجة معملية مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسحه جافاً مع نسيج مختبر جاف. فصل التحقيق من المحول والمخزن.بعد هذا، مسح أسفل جميع الأسطح في غطاء محرك السيارة مع 1٪ SDS تليها 70٪ الإيثانول. للبدء، ضع أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية السيليكونية في سحب إبرة زجاجية. بدوره على عنصر التدفئة، والسماح للأوزان المرفقة لتمتد أنبوب الشعرية الزجاجية ساخنة.بعد ذلك ، استخدم المقص لقطع أنبوب الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة عند أنحف نقطة في الوسط وإزالة الإبرة الزجاجية من سحب الإبرة الزجاجية. ثم، استخدام مقص لقطع طول أنبوب التفاف تقليص إلى حوالي 40 ملم. حرك التفاف يتقلص على إبرة معدنية من حقنة 10 ميكروليتر مشطوف.استخدام لهب مفتوح لتسخين والتمسك التفاف يتقلص إلى الإبرة، مع التأكد من تدوير الإبرة لتطبيق الحرارة بالتساوي. حرك الطرف الأكبر من إبرة الزجاج المسحوبة بعناية فوق الإبرة المعدنية للحقنة. بعد هذا، وقطع طول أنبوب التفاف يتقلص إلى ما يقرب من 40 ملم وشريحة بعناية على إبرة الزجاج لتداخل قاعدة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية من حقنة.استخدام لهب مفتوح لتسخين لفة يتقلص لتأمين إبرة الزجاج إلى إبرة معدنية. لمزيد من تأمين الإبرة ومنع التسريبات المحتملة، وقطع طول إضافي من أنابيب التفاف يتقلص إلى ما يقرب من 40 ملم، وشريحة بعناية على إبرة الزجاج لتداخل قاعدة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية من الحقنة. استخدام لهب مفتوح لتسخين لفة يتقلص لتأمين إبرة الزجاج إلى إبرة معدنية.ثم، استخدم المقص لتقليم إبرة الزجاج بحيث يكون الطرف حوالي 8 مم طويلة. لاختبار الإبرة، تعبئة حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26 المرفقة مع الماء المقطر. إزالة المكبس المعدنية من حقنة إبرة الزجاج المخصصة وإدراج إبرة حقنة مملوءة بالماء في قاعدة الحقنة المخصصة.فحص واجهة إبرة الزجاج والإبرة المعدنية للتسربات وللتأكد من تدفق المياه بشكل ثابت. ثم املأ أنبوب جهاز طرد مركزي صغير بالماء المقطر. استخدام حقنة إبرة الزجاج المخصصة لرسم في الماء المقطر.فحص الإبرة للتأكد من أخذ السائل في الحقنة وأنه لا توجد فقاعات. إذا كانت هناك فقاعات، أو إذا لم يتم رسم الماء في الإبرة، يمكن أن يساعد تقليم الإبرة في تخفيف الضغط. بعد ذلك، قم بتخزين الحقنة بعناية مع الإبر الزجاجية المرفقة، في صناديق الحقنة حتى الحاجة إلى العمليات الجراحية.الفحص مع المجهر الإلكترون انتقال يؤكد وجود fibrils طويلة. وبالمقارنة، فإن مونومرات ألفا-سينوكلين هي الشعير المرئي وليس لها شكل ملحوظ. ثم يتم تأكيد analoid من fibrils باستخدام ثيوفلافيين T Assay.يظهر مقايسة تمثيلية dPBS والمونومات الماوس تنتج إشارة أقل في وحدات دقيق نسبية مقارنة بففس الماوس. بينما PFFs الإنسان وبالمثل تنتج إشارة أعلى من مونومرات.إلى القنين وجود فيبريلات قابلة للقذف ، يتم إجراء مقايسة الترسيب. في كل من الماوس وعينات PFF الإنسان، وينبغي أن يكون أكثر من البروتين في بيليه من فوق. في المقابل، فإن غالبية البروتين من الماوس والمونومات البشرية موجودة في عظمى مع وجود القليل في بيليه.كل من الماوس وPFFs الإنسان هي سونيكاتيد لإنتاج PFFs من أطوال مناسبة لبذاءات ألفا synuclein إدراج. ويكشف فحص شامل لحوالي 500 فيبريلس أن متوسط طول الفيبرات الماوس هو ما يقرب من 44 نانومتر. مع 86.6٪ من PFFs قياس 60 نانومتر أو أقل.ومع ذلك، يبلغ متوسط طول PFFs البشري حوالي 55.9 نانومتر مع 69.6٪ من PFFs قياس 60 نانومتر أو أقل. في فحص vivo فعالية PFF وأكد باستخدام الكيمياء المناعية. إدراج تشكلت في النيجرا substantia، حصة خصائص مماثلة للأجسام ليوي في أنها تحتوي على synuclein ألفا الفوسفورية، تحتوي على هياكل أمينلوييد، وصمة عار مع ثيوفلافين S، ومقاومة للهضم البروتينات K.Sonication يمكن أن يعرض sonicating الفردية إلى الفيبريلز المتشكلة الهباء الجوي. على هذا النحو، يجب ارتداء ملابس السلامة المناسبة وينبغي تنفيذ سونيكيشن في غطاء محرك السيارة لتقليل خطر التعرض.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...