المؤلفين أشكر تريسي يونغ بيرس واتسوشي كاميا لتوفير البلازميدات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الخلايا العصبية، ERANET اكتشاف لأو وCK (BMBF 01EW1003)، DFG (كو 1679/3-1؛ GRK1033) لCK، و (DE 792/2-4) إلى MASS

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155 (2002).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Young-Pearse, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+for+beta-amyloid+precursor+protein+in+neuronal+migration+revealed+by+in+utero+RNA+interference.">A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Sapir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+balance+of+the+polarity+kinase+MARK2/Par-1+is+required+for+proper+cortical+neuronal+migration.">Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).</li><li>Weinberger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+neuropathology+to+neurodevelopment.">From neuropathology to neurodevelopment.</a> Lancet. 346, 552-557 (1995).</li><li>Murray, R. M., Lewis, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+schizophrenia+a+neurodevelopmental+disorder?.">Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?.</a> British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).</li><li>Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+schizophrenia-associated+mutation+of+DISC1+perturbs+cerebral+cortex+development.">A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development.</a> Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).</li><li>Miyoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-In-Schizophrenia+1,+a+candidate+gene+for+schizophrenia,+participates+in+neurite+outgrowth.">Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth.</a> Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).</li><li>Mao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+in+schizophrenia+1+regulates+neuronal+progenitor+proliferation+via+modulation+of+GSK3beta/beta-catenin+signaling.">Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling.</a> Cell. 136, 1017-1031 (2009).</li><li>Millar, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-in-Schizophrenia+1+(DISC1)+is+necessary+for+the+correct+migration+of+cortical+interneurons.">Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).</li><li>Niwa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+in+utero+gene+transfer+disturbs+postnatal+dopaminergic+maturation+in+the+frontal+cortex+and+leads+to+adult+behavioral+deficits.">Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits.</a> Neuron. 65, 480-489 (2010).</li><li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+as+a+tool+for+genetic+manipulation+in+vivo+to+study+psychiatric+disorders:+from+genes+to+circuits+and+behaviors.">In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors.</a> The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).</li><li>Bai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation.">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 41, 335-344 (1999).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphetamine-induced+sensitized+state+as+a+model+of+schizophrenia.">The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia.</a> Progress in Neuro-psychopharmacology &amp; Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).</li><li>Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

واضعو هذه الدراسة لم يكن لديك مصلحة مالية في هذه الدراسة والتي لم يتم برعاية الصناعة لهذه الدراسة. وقد ساهمت رسوم مفتوح وصول PERKINELMER شركة نشر آخر.

يوضح دراستنا أن IUE هي مناسبة لتوليد الفئران الكبار مع الخلايا العصبية تعبر عن التحوير في منطقة انتقائية من الدماغ، وأنه نتيجة لهذا التدخل، هذه الحيوانات تظهر التغييرات في السلوك يشير إلى وظيفة من التلاعب يؤدونها. في هذه الدراسة، على سبيل المثال، أظهرت الفئران overexpressing DISC1 جانب واحد في جزء صغير من قشرة الفص الجبهي فرط الحساسية تجاه المنشطات (الشكل 9). اختيار الفئران للنجاح التثقيب الكهربائي في الجسم الحي بواسطة التصوير تلألؤ بيولوجي كان فعالا في السيطرة على التنوع الكامن ترنسفكأيشن الخلية IUE وتم تطبيقها لتوليد مجموعات بمساحة IUE متجانسة من انخفاض التباين بين الموضوع للتحقيقات في وقت لاحق. في هذه الدراسة، لم نتمكن من تحديد الجراء electroporated من القمامة عن طريق الكشف عن electroporated شارك في مضان GFP التي يسببها في الحيوان حديثي الولادة، حتى ثوهتاف اشمئزاز في نفس الوقت وفي نفس الحيوان يمكن أن يتم الكشف عن إشارة تلألؤ بيولوجي من luciferase المراسل بالتساوي شارك electroporated بعد حقن وسيفيرين (الشكل 6)، وكانت لا تزال في التعبير عن GFP الخلايا العصبية الموجودة في الدماغ في سن ستة أشهر. نستنتج أنه في الفئران، فإن رد الفعل luciferase المراسل / وسيفيرين هي مناسبة تماما للتمييز بين الحيوانات مع العقول electroporated الناجحة (الشكل 3). رصد الكمي للنجاح IUE تتعلق قوة الإشارة تلألؤ بيولوجي التي تقاس التهم من الفوتونات في نفس الوقت التعرض (الشكل 3) ويتوافق مع النشاط الأنزيمي من luciferase المراسل أعرب المشترك. إشارات تلألؤ بيولوجي صغيرة قابلة للكشف من قبل 100-200 التهم من الفوتونات، و، في وهج ~ 1X10 4 الفوتونات / ثانية / سم 2 / المعرض ستيراديان 1،000-2،000 الخلايا ملطخة GFP في الأنسجة في الدماغ الفئران 6 أشهر من العمر. أعلى DISP إشارةالأصغر حجما إشعاع تصل إلى ~ 5X10 6 الفوتونات / ثانية / سم 2 / ستيراديان و~ 64،000 التهم الموجهة إليه. في سلالة الفئران سبراغ داولي المستخدمة، لاحظنا ضعف إشارة تلألؤ بيولوجي طوليا مع زيادة العمر وإشارة اختفى بعد سن P35 (الشكل 4). عند هذه النقطة، ونحن لا نعرف ما إذا كان إما عابرة، البلازميد التعبير المستندة إلى متجه من luciferase المراسل النقصان، أو إذا كانت إشارة تلألؤ بيولوجي يضعف بسبب زيادة كتلة الدماغ، أو كليهما هي أسباب إشارة الزوال. للمقايسة وظيفية موجودة في الفئران الكبار، وجاء اختيار للدراسات السلوكية مجرد استنادا إلى موقع للإشارة، ولكن ليس من تلألؤ بيولوجي قوة الإشارة. على الرغم من الرصد الكمي تلألؤ بيولوجي 3D يسمح التمايز بين المناطق المختلفة electroporated (الشكل 5)، وكان لها accurateness محدودة للخلايا الواقعة في عمق الدايميظهر nsion من الدماغ. الشكل 6 مثال على التثقيب الكهربائي الحصين حيث قياس تلألؤ بيولوجي في 2D و 3D الصورة تدل على وجود المواقع الجيدة للالتثقيب الكهربائي. في تشريح الدماغ بعد الوفاة، تم الكشف عن إشارة GFP مضان في حوالي نفس الموقف إشارة تلألؤ بيولوجي، مشيرا إلى استهداف الصحيح الحصين. ولكن يظهر أن الأنسجة أيضا الخلايا في القشرة الظهرية من الحصين قد تم استهداف (الشكل 7). هذا يشير إلى أن فحص تلألؤ بيولوجي هو أداة مفيدة للكشف عن الإيجابية، الجراء IUE وأيضا لدينا فكرة عن المنطقة electroporated، ولكن، في نهاية المطاف، والتصوير لا يمكن أن تحل محل الأنسجة بعد الوفاة بالضبط توطين الخلايا المستهدفة بشكل إيجابي. مظاهرة لدينا يشير إلى وعد لتطبيق التكنولوجيا IUE لتوليد التلاعب استهدفت خفية من مناطق الدماغ القشرية أو قرن آمون لمحاكاة aberrances في جالهجرة ortical أو العيوب العصبية النمائية الأخرى التي قد تؤثر على حيوان بالغ. بينما التثقيب الكهربائي الثنائية 26 لديه ميزة وجود تأثير أكبر على الأرجح السلوك، وهناك أيضا أكثر من وفيات الأجنة. وقد تم اختيار التثقيب الكهربائي من جانب واحد من أجل المقارنة بين نصفي الكرة الأرضية مع واحدة باعتبارها الرقابة الداخلية، وكذلك لإظهار أنه حتى التلاعب IUE في جانب واحد، منطقة صغيرة كافية لتغيير السلوك. وبالتالي قد يكون ذلك حافزا التغييرات IUE التي يسببها في الاتصال بين الخلايا العصبية أو الهندسة المعمارية دون إثارة آفة ومباراة المطلوب من المنطقة ليكون بين IUE التلاعب مع الاختبار السلوكية المناسبة يعتمد على مسألة علمية. مشكلة اطلاق النار تخفيض حجم القمامة وهناك عدة اقتراحات بشأن زيادة بقاء الجراء IUE. أولا، واستخدام الزجاج الشعيرات الدموية رقيقة جدا خلال التثقيب الكهربائي من أجل تقليل الأنسجة lesioينصح ن. الثانية، لا electroporate الجنين الأولى في نهاية المهبل كل قرن الرحم: موت الجنين المولود الأول يزيد من فرص إحباط جميع الأجنة الأخرى. الثالث، بعد الولادة، وغالبا ما تقتل الفئران الأم جزءا من ذريتها بسبب الإجهاد في الفترة المحيطة بالولادة. من أجل الحد من التوتر إضافية، لا تبدأ مع التصوير الحي مباشرة بعد الولادة، ولكن الانتظار لمدة سبعة أيام. الكشف عن GFP مضان من الجراء في أسبوع واحد بعد الولادة، أي إشارة مضان إما باستخدام مجهر مضان الحية المجهرية أو التصوير التصوير مضان مع الطيف IVIS (epifluorescence وسائط transfluorescence؛ لGFP الإثارة / الانبعاثات: 465/520 نانومتر و 500/540 نانومتر). فمن الممكن أن حد سواء، وانتقال محدود من الطول الموجي القصير الإثارة وانبعاث الضوء من خلال الأنسجة مثل الجمجمة والخلفية تألق ذاتي عالية من الجلد منع استخدام مضان تحت تنازلياribed الأوضاع في الفئران. كما هو مبين في الشكل (6)، ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن إشارة luciferase المراسل في الحيوانات التي تعيش في تشريح الدماغ (دون الجمجمة) وهناك، أيضا إشارة مضان قابلا للاكتشاف (الشكل 6D). التفريق بين تلألؤ بيولوجي في مناطق الدماغ متباعدة عن كثب حتى في الرسم التوضيحي 3D لا يمكن توقع موقع منطقة تلألؤ بيولوجي إلى 100٪. ويمكن أيضا خصوصا الخلايا على أعلى أو أقل من مجال وتوقع أن تستهدف بطريق الخطأ وtransfected. الموضع الدقيق له أن يسيطر عليها بعد الوفاة (مضان) الأنسجة (انظر الشكل 7).

تطوير في الرحم التثقيب الكهربائي (IUE) الطريقة التي يسمح التشكيل التعبير الجيني في الدماغ النامية، كانت من خلال كسر لأنها مكنت دراسة النمو العصبي مع السهولة النسبية. 1-7 التغيرات في مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة في وقد أظهرت منطقة محددة في الدماغ أثناء التطور الجنيني و / أو فترة ما حول الولادة في القوارض لانتقادية تأثير انتشار الخلايا العصبية، والهجرة، تشجر، والاتصال. 8-10 الفصام هو مرض عقلي معقد مع الأعراض الحادة والمزمنة التي تم المتصلة تشوهات العصبية النمائية 11، 12، وبالتالي العديد من الجينات التي تم تحديدها لمرشح الفصام يتم التحقيق للآثار المحتملة على النمو العصبي تحوير، مثل على سبيل المثال لعطل في والفصام -1 (DISC1) الجين 13-15. نمو الدماغ هو regulatإد بواسطة العوامل الوراثية وتفاعلها مع البيئة التي تلعب دورا في، قبل فترات التنموية شبه وبعد الولادة. أحد العوامل الرئيسية للمخاطر الوراثية الاضطرابات السلوكية المختلفة هو DISC1 16 الجينات. DISC1 يؤدي ضربة قاضية لعيوب الهجرة في الفئران 13، 17، ولقد ثبت التلاعب التعبير DISC1 في القشرة النامية عن طريق IUE للتأثير سلوك الفئران البالغة 18. التلاعب التعبير الجيني الدماغ عن طريق IUE ديها العديد من المزايا أكثر من 19 جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا خطوط. الأولى، ويتحقق التعبير الجيني داخل المناطق ذات الاهتمام في غضون أسابيع أو شهور بدلا من عدة أجيال من تربية القوارض خطوط المعدلة وراثيا. الثانية، وتجنب الآليات التعويضية خلال التنمية في وقت مبكر قد الظواهر حماية الحيوانات في الهندسة سلالة الجرثومية 20. الثالث، من خلال استهداف سوى السكان خلية معينة أو منطقة معينة من الدماغ، migratiأو الاختلافات الانتشار ويمكن مقارنة مباشرة مع غير متحولة أو السيطرة على الجانب المقابل إذا يتم اختيار electroporations من جانب واحد. من ناحية أخرى، لا يملك IUE دقة يحركها المروج لجنة المساواة العرقية / التي يسببها سمك مدخن توقيت التعبير وفقط جزء من السكان من الخلايا في منطقة معينة ويستهدف مما يؤدي إلى نوع من الفسيفساء نمط التعبير الجيني. للعديد من التطبيقات التجريبية في القوارض الكبار، وهو ترنسفكأيشن عابرة من عدد محدود من الخلايا في منطقة المخ قد تكون كافية، أو حتى المرجوة، حتى أن الميزة الرئيسية لاستقرار والقوارض-سلالة الجرثومية المعدلة وراثيا لا يكاد يذكر. في الواقع، IUE مفيد للتحقيق في ما إذا كانت بعض الخلايا بشكل غير طبيعي قد تؤثر تطوير شبكة كاملة من الخلايا أو الدوائر. قد تكون ميزة أخرى القدرة على إظهار الآثار غير من الجينات خلية مستقلة نظرا لطبيعة الفسيفساء للضرب. وعلاوة على ذلك، فإن الجيل من الفئران المعدلة وراثيا وخروج المغلوب لا تزال في مهدها، واستخداممن IUE في هذا النوع لدراسة عواقب نمو الدماغ الشاذة هي من الفائدة المرتفعة. حتى الآن، عقبة رئيسية استخدام IUE عن التحقيق في عواقب التدخل في تلك الحيوانات مثل البالغين هو عدم النجاح الرصد التثقيب الكهربائي. حتى الآن، GFP المشارك transfected-الفلورسنت الخلايا العصبية في الفئران حديثي الولادة الجراء الحية لا يمكن أن يتم الكشف عن تحت المجهر مضان مجهر مناسبة أو مع التصوير مضان من الطيف IVIS. للتغلب على هذه العقبة، ونحن نشارك في transfected الجين مراسل luciferase وتنفيذ تلألؤ بيولوجي التصوير الحي من الجراء قبل 3 الأبعاد (3D) الكميات من منطقة الدماغ IUE. كمثال لبيان مدى انطباق هذا الأسلوب في فحص وظيفية في وقت لاحق اختبار التلاعب الجيني النمو العصبي، وحقن المشارك البلازميدات تحتوي على DISC1 الإنسان، luciferase المراسل، وGFP إلى البطين الجانبي من أجنة الفئران <suتم تنفيذ ع&gt; 3 تليها التثقيب الكهربائي مع القطب منتاش. في حين لا يمكن أن يتم الكشف عن إشارات مضان في مراحل ما بعد الولادة في الجسم الحي، تم الكشف عن إشارة تلألؤ بيولوجي الصلبة المستمدة من التمثيل الغذائي وسيفيرين بواسطة transfected المشترك الجين luciferase المراسل تصل إلى خمسة أسابيع بعد الولادة. 3D-قياسات electroporated منطقة الدماغ يسمح الكمي حيث تم تحديد الجراء مع كافية أو في غير محله التثقيب الكهربائي منذ البداية، وبالتالي، تمكين التنازل عن الحيوانات IUE (الجينات في المصالح وسارعت السيطرة) إلى المجموعات التجريبية مع المتطابقة مناطق الدماغ electroporated تقلب منخفض . وقد تجلى استخدام الفئران IUE الكبار في النماذج السلوكية كمثال على فائدة من هذا البروتوكول.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

<html> في الرحم التثقيب الكهربائي (IUE) هو الأسلوب الذي يسمح التعديل الوراثي للخلايا في الدماغ عن التحقيق في تطوير الخلايا العصبية. حتى الآن، واستخدام IUE للتحقيق في السلوك أو أمراض الأعصاب في الدماغ الكبار كان محدودا من قبل وسائل كافية لرصد نجاح ترنسفكأيشن IUE بواسطة تقنيات غير الغازية في الحيوانات بعد الولادة. لهذه الدراسة، تم استخدام الفئران E16 لIUE. بعد الحقن داخل البطينات من الأحماض النووية في الأجنة، وتحديد المواقع من الأقطاب منتاش الحرجة لاستهداف إما القشرة النامية أو قرن آمون. البطين شارك في حقن و electroporation من الجينات يسمح luciferase المراسل رصد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل بعد الولادة بعد الحقن داخل الصفاق وسيفيرين في تخدير الجرو P7 الحية في الجسم الحي بواسطة تلألؤ بيولوجي، وذلك باستخدام جهاز الطيف IVIS مع برنامج 3D الكمي. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; تعريف المنطقة التي كتبها تلألؤ بيولوجي يمكن التمييز بوضوح بين electroporations القشرية وقرن آمون والكشف عن إشارة طوليا مع مرور الوقت تصل إلى 5 أسابيع بعد الولادة. سمحت هذه التقنية التصوير لنا لتحديد الجراء مع وجود عدد كاف من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل يفترض اللازمة لتحريك الآثار البيولوجية، وبعد ذلك لأداء التحقيقات السلوكية في 3 أشهر من العمر. كمثال على ذلك، توضح هذه الدراسة أن IUE مع الإنسان DISC1 كامل طول الجين في الفئران القشرة أدت إلى فرط الحساسية المنشطات. يمكن أن يتم الكشف عن GFP transfected المشارك في الخلايا العصبية عن طريق التشريح المجهري مضان في cryosections يدل التعبير الجيني موجودا في ≥ 6 أشهر بعد الولادة. فإننا نستنتج أن التصوير تلألؤ بيولوجي يسمح بعدها تقييم نجاح transfections عابرة مع IUE في الفئران. تحقيقات حول تأثير التلاعب الجيني الموضعية خلال neurodevelopmenر على الدماغ الكبار والاتصال به وسهلت إلى حد كبير. بالنسبة لكثير من المسائل العلمية، ويمكن هذا الأسلوب تكملة أو حتى استبدال استخدام الفئران المعدلة وراثيا، وتوفير تكنولوجيا جديدة لعلم الأعصاب السلوكي.

<html> ويبين الشكل 3 يعيش القياسات التصوير من ثلاثة الفئران الوليدة في P7 بعد حقن 150 ملغ وسيفيرين / كجم من وزن الجسم. الاختلافات في قوة الإشارة التي تشير إلى التباين في كفاءة IUE مرئية. وسجلت إشارات تلألؤ بيولوجي قوي حتى P36 (الشكل 4). في الشكل 5، وصفت القدرة على تحديد القشرية (أرقام 5A و5C) وقرن آمون (أرقام 5B و 5D) التثقيب الكهربائي عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي. وصفت علاقة للإشارة تلألؤ بيولوجي (الشكل 7A) مع إشارة مضان لها بعد إزالة الجمجمة (الشكل 7B) والخلايا electroporated GFP المقابلة في الدماغ cryosectioned (الشكل 8) في P14 في أرقام 6-8. من المذكرة، لم يكن هناك الكشف عن إشارة مضان في الفئران الحية في أي نقطة زمنية. خيمة &quot;&gt; في الجسم الحي التصوير تلألؤ بيولوجي يمكن التمييز التقريبية لمناطق الدماغ electroporated مختلفة من قبل 2D (أرقام 5A و 5B) التي تحسنت كثيرا مع برنامج DLIT من البرنامج IVIS الطيف توليد 3D الصور (أرقام 5C و 5D). في الأمثلة المعروضة ، يمكن تمييز التثقيب الكهربائي للقشرة الفص الجبهي والحصين. وتجدر الإشارة إلى أنه في حين تهدف ل electroporate الحصين، وبعض الخلايا الاصلية للقشرة الكذب الظهري للقرن آمون كما يمكن ضرب (الشكل 7). وقد تم التحقيق من جانب واحد في الرحم الفئران electroporated مع ناقلات pCAX في القشرة وبالتالي overexpressing كامل طول DISC1 الإنسان على حد سواء العفوية والتي يسببها الأمفيتامين فرط النشاط مثل البالغين. وكانت الفئران electroporated مع pCAX-DISC1 شديدة الحساسية لجرعة منخفضة من المنشطات. انتقلت هذه الفئران بشكل ملحوظ موإعادة بعد العلاج من المنشطات بعد لحقن المياه المالحة، في حين أن الحيوانات لم تحكم (الشكل 10). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط لموقف القطب A) التثقيب الكهربائي القشرة وباء) التثقيب الكهربائي الحصين؛ الخضراء = حقن الحمض النووي ميكس داخل البطين. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> الشكل 2. رد فعل luciferase المراسل. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> الرقم 3. قياس التلألؤ من الفئران P7 بعد حقن 150 ملغم / كغم من وزن الجسم luciferine؛ زمن التعرض 180 ثانية؛ A) الفئران مع عدم وجود إشارة التلألؤ؛ B) الفئران<html> مع إشارة ضعيفة تلألؤ بيولوجي؛ C) الفئران مع إشارة التلألؤ قوية. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> الشكل 4. خط الزمن من القياسات تلألؤ بيولوجي متتالية من نفس الفئران بعد حقن 150 ملغم / كغم luciferine إظهار نافذة زمنية كبيرة حيث يمكن أن يتم الكشف عن نجاح IUE. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . الرقم 5 توضيحات من الاختلافات بين التثقيب الكهربائي القشرية وقرن آمون في P7 A) B و) الصور 2D؛ C) &amp; D) صور 3D، A) &amp; C) من القشرة؛ B) &amp; D) من الحصين.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> الرقم 6. التوضيح من E16 التثقيب الكهربائي الحصين من الجرو الفئران في P14 A)-2D صورة تلألؤ بيولوجي B) التوضيح 3D من تلألؤ بيولوجي إشارة C) تشريح الدماغ مع تلألؤ بيولوجي إشارة D) الدماغ مع GFP إشارة برنامج التحصين الموسع ومضان. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> الرقم 7. التفاصيل من صورة مضان من قسم البرد 20 ميكرومتر من نفس P14 الدماغ الفئران electroporated مع GFP البلازميد والتي تحتوي على luciferase المراسلناقلات، نوى تلطيخ مع دابي؛ CA1-3 = كورنو آمون 1-3؛ DG = التلفيف المسنن؛ FC = Fasciolarum الرمادية. الفيديو 1. 3D الرسوم المتحركة من الحصين electroporated الفئران في P14. <img alt="الرقم 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> الرقم 8. المنشطات اختبار مخطط: حقن المياه المالحة اليوم الأول قبل المحاكمة 15 دقيقة، 24 ساعة في وقت لاحق حقن المنشطات قبل إجراء الاختبار في غرفة حقل مفتوح. <img alt="الرقم 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> الرقم 9. اختبار المنشطات. شريط يظهر الرسم البياني مسافة المنقولة (في سم) للحيوان سجلت عن طريق نظام TrueScan أكثر من 15 دقيقة القضبان الأبيض = المجموعة الضابطة؛ القضبان الرمادية = DISC1 مجموعة overexpressing، ومراقبة مجموعة ن = 10؛ DISC1 مجموعة من overexpression ن = 11؛ أنوفا: * العلاج جينو ع = 0.043؛ تي اختبار لمجموع المالحة الوقت مقابل نانوثانية المنشطات = لا pcontrol كبيرة = 0.172، 0.001 = pDISC1.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening at JoVE.com

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

يمكن التلاعب الجينات خلال تطوير القشرة أو الحصين من الفئران في الرحم عن طريق التثقيب الكهربائي (IUE) في E16، لتمكين تعديلات سريعة وهادفة في اتصال الخلايا العصبية للدراسات في وقت لاحق من السلوك أو أمراض الأعصاب في الحيوانات البالغة. يتم تنفيذ ما بعد الولادة في التصوير المجراة من أجل السيطرة على نجاح IUE بواسطة تلألؤ بيولوجي تفعيل luciferase المراسل transfected المشترك.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K Views.  Medical School Düsseldorf.  يمكن التلاعب الجينات خلال تطوير القشرة أو الحصين من الفئران في الرحم عن طريق التثقيب الكهربائي (IUE) في E16، لتمكين تعديلات سريعة وهادفة في اتصال الخلايا العصبية للدراسات في وقت لاحق من السلوك أو أمراض الأعصاب في الحيوانات البالغة. يتم ت?...

Video: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.