Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

نود أن نشكر المراجعين على ملاحظاتهم المفيدة. وقد تم دعم A.N.S. من قبل مؤسسة غوردون وبيتي مور من خلال منحة GBMF 255.03 لمؤسسة بحوث علوم الحياة.

1. إعداد سلالات لCoincubation
<ol><li>اختيار سلالة المرجعية المناسبة التي من شأنها أن تكون بمثابة الهدف للمنافسة البكتيرية خلال اختبار coincubation. راجع المناقشة للاطلاع على أفضل الممارسات عند تحديد سلالة مرجعية وكيفية تأثير السلالة المرجعية على النتائج. في هذا البروتوكول، V. fischeri سلالة ...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

يوفر تصنيف التكعيبات الموضحة أعلاه طريقة قوية لاكتشاف المنافسة بين البكتيريا. وسمح هذا النهج بتحديد المنافسة الداخلية بين V. fischeri isolates وتوصيف الآلية التنافسية19. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة تم تحسينها للبكتيريا البحرية V. fischeri، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب...

تحدد هذه المخطوطة طريقة قائمة على الثقافة لتحديد ما إذا كان عزلتان بكتيريتان قادرتين على التفاعل التنافسي. عند دراسة السكان المختلطين، من المهم تقييم مدى تفاعل العزلات البكتيرية، لا سيما ما إذا كانت المعزولات تتنافس مباشرة من خلال آليات التداخل. تشير المنافسة على التداخل إلى التفاعلات التي يمنع فيها أحد السكان بشكل مباشر النمو أو يقتل السكان المنافسين1. هذه التفاعلات مهمة لتحديد لأنها يمكن أن يكون لها آثار عميقةعلى بنية المجتمع الميكروبي ووظيفته 2،3.
وقد تم اكتشاف آليات للمنافسة الميكروبية على نطاق واسع في جينومات البكتيريا من بيئات متنوعة بما في ذلك كل من البكتيريا المرتبطة بالمضيف والبكتيريا الحية الحرة4،5،6،7، 8،9. وقد تم وصف مجموعة متنوعة من استراتيجيات المنافسة10،11 بما في ذلك آليات غير قابلة للاختراق، مثل المواد الكيميائية مبيدة للجراثيم1،12 والببتيدات المضادة للميكروبات تفرز13 ، وكذلك الآليات المعتمدة على الاتصال التي تتطلب اتصال الخلية لنقل تأثيرمثبط إلى الخلايا المستهدفة 9،14،15،16،17 ،18.
على الرغم من أن التكعيبات القائمة على الثقافة تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة5و8و19،فإن هذه المخطوطة تحدد كيفية استخدام التدقيق لتوصيف آلية المنافسة، فضلاً عن اقتراحات للتكيف بروتوكول للاستخدام مع الأنواع البكتيرية الأخرى. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الطريقة نُهجاً متعددة لتحليل البيانات وعرضها للإجابة على أسئلة مختلفة حول طبيعة التفاعلات التنافسية. على الرغم من أن التقنيات الموصوفة هنا استخدمت سابقا لتحديد آلية القتل بين البكتيريا الكامنةالكامنة داخل المنافسة المحددة بين سلالات تكافلية من البكتيريا Vibrio fischeri معزولة co9 ، فهي مناسبة ل العديد من الأنواع البكتيرية بما في ذلك العزلات البيئية ومسببات الأمراض البشرية، ويمكن استخدامها لتقييم كل من الآليات التنافسية المعتمدة على الاتصال وغير القابلة للاختراق. وقد تتطلب الخطوات المتخذة في البروتوكول تحسين الأنواع البكتيرية الأخرى. وبالنظر إلى أن المزيد من النظم النموذجية توسع دراساتها إلى ما بعد استخدام الكائنات المسببة للسرطان لتشمل مختلف الأنماط الجينية10و16و20و21،فإن هذه الطريقة ستكون مورداً قيماً للباحثين الذين يسعون إلى فهم كيفية تأثير المنافسة على الأنظمة متعددة السلال أو الأنواع المتعددة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

تصف هذه المخطوطة اختبارًا قائمًا على الثقافة وتكعيباً للكشف عن التفاعلات التنافسية بين اثنين من التجمعات البكتيرية ووصفها. وتستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تسمح لكل مجموعة من السكان بأن تكون الموسومة بشكل مختلف بقدرات مقاومة المضادات الحيوية المتميزة والبروتينات الفلورية للاختيار والتمييز البصري لكل شعب، على التوالي. هنا، نقوم بوصف إعداد وتكتكع سلالات Vibrio fischeri المتنافسة، والتصوير المجهري الفلوري، وتحليل البيانات الكمية. وهذا النهج بسيط، ويسفر عن نتائج سريعة، ويمكن استخدامه لتحديد ما إذا كان أحد السكان يقتل أو يعوق نمو سكان آخرين، وما إذا كانت المنافسة تتوسط من خلال جزيء غير قابل للاستخدام أو تتطلب الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية. ولأن كل مجموعة بكتيرية تعبر عن بروتين فلورسنت مختلف، فإن هذا التحليل يسمح بالتمييز المكاني للسكان المتنافسين داخل مستعمرة مختلطة. على الرغم من أن يتم تنفيذ الأساليب الموصوفة مع البكتيريا التكافلية V. fischeri باستخدام الظروف الأمثل لهذا النوع، يمكن تكييف البروتوكول لمعظم العزلات البكتيرية القابلة للزراعة.

من أجل تقييم التفاعلات التنافسية بين السكان البكتيرية، تم وضع بروتوكول فحص coincubation والأمثل لV. fischeri. تستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تقوم بترميز جينات مقاومة المضادات الحيوية والبروتينات الفلورية، مما يسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة. من خلال ?...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

البكتيريا ترميز آليات متنوعة للانخراط في المنافسة بين البكتيريا. هنا، نقدم بروتوكولاً قائماً على الثقافة لتوصيف التفاعلات التنافسية بين العزلات البكتيرية وكيفية تأثيرها على البنية المكانية للسكان المختلطين.

اختبار تكعيبي لتحديد التفاعلات التنافسية بين عزل فيبريو فيشري

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

بروتوكول لدينا يوفر نهجا بسيطا ولكن قوية لتحديد وتوصيف الآليات التنافسية بين سلالات مختلفة من البكتيريا فيبريو fischeri. تستخدم هذه الطريقة البلازميدات المستقرة التي تشفّر جينات مقاومة المضادات الحيوية المختلفة والبروتينات الفلورية التي تسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة بكتيرية في ثقافة مختلطة. للبدء ، استخدم مسواك معقمة لكشط الخلايا من صفيحة أجار في حجم حبة الأرز.Resuspend الخلايا في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge التي تحتوي على ملليلتر واحد من مرق LBS. لتفريق كتل الخلية، اضغط عليها في جانب الأنبوب ومن ثم ماصة صعودا وهبوطا بقوة. أغلق الأنبوب ودوامة لمدة ثانية إلى ثانيتين وكرر إذا كانت كتل الخلية لا تزال مرئية حتى تكون العينة موحدة بصرياً.كرر خطوات التحضير هذه من كشط الخلايا إلى الدوامة لجميع العينات. قياس وتسجيل الكثافة البصرية في 600 نانومتر لجميع العينات. للحصول على قياس دقيق لـ OD، قم بتخفيف العينات حتى 10 أضعاف باستخدام مرق LBS.ثم تطبيع كل عينة إلى OD المطلوب 600. لخلط سلالة مرجعية وسلالات منافس في نسبة واحد إلى واحد، إضافة 100 ميكرولترات من كل سلالة تطبيعها إلى OD 1.0 إلى 1.5 ملليلتر المسمى أنبوب الطرد المركزي ودوامة لمدة ثانية إلى ثانيتين. كتحكم، اخلطي السلالة المرجعية مع نسخة مُوسومة من نفسها و دوامة أيضاً.ومن الأهمية بمكان تحقيق نسبة البداية الصحيحة لأنها يمكن أن تغير إلى حد كبير نتيجة التجربة. لضمان النجاح، قد تتطلب هذه الخطوة تحسين الأنواع البكتيرية معينة. وبعد تكرار هذه الخطوة لكل تكرار بيولوجي، ينبغي أن تكون هناك أربع نسخ بيولوجية متماثلة مع سلالات مرجعية مُوسَّمة بشكل تفاضلي كضوابط وأربعة سلالات بيولوجية مع سلالات مرجعية ومنافسة ذات علامات تفاضلية.لجعل البقع الثقافة التي سيتم استخدامها للمجهر الفلوريسنس بعد الحضانة، إضافة 10 ميكرولترات من كل عنصر تحكم والخليط التجريبي على لوحة بيتري التي تحتوي على LBS أجار. بعد أن جفت البقع تماما على مقاعد البدلاء، احتضان لوحات في 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. لجعل البقع الثقافة التي سيتم استخدامها لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة لكل سلالة في نهاية التجربة، إضافة 10 ميكرولترات من كل عنصر تحكم والمخاليط التجريبية في 24 لوحات البئر التي تحتوي على ملليلتر واحد من LBS أجار في البئر.بعد أن جفت البقع تماما، احتضان لوحات في 24 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. لتنفيذ تخفيف تسلسلي من بدء خلطات العملة، تدوير 96 لوحة جيدا 90 درجة حتى لا يكون هناك ثمانية أعمدة و 12 الصفوف. تسمية كل صف مع معرف سلالة، رقم النسخ المتماثل، والوقت بدءاً من t صفر.تسمية لوحات Agar LBS تكملها بالمضادات الحيوية المناسبة التي على الفور سلسلة التخفيف مع التأكد من تحديد أي سلالة كل لوحة المضادات الحيوية يتم اختيار ل. مع ماصة متعددة القنوات، إضافة 180 ميكروليت من مرق LBS إلى كل بئر ترك العمود الأول فارغة لخليط عمله غير مخفف. باستخدام ماصة قناة واحدة 200 ميكرولتر، نقل 100 ميكرولترات من خليط عمله من الأنبوب إلى البئر الأولى من العمود الأول، ثم تجاهل طرف وكرر لجميع خلطات العملة.مع ماصة متعددة القنوات، نقل 20 ميكرولترات من العمود الأول إلى عمود اثنين وماصة صعودا وهبوطا لخلط. تجاهل النصائح وكرر لكل عمود في حين يجري متسقة مع عدد من الأنابيب صعودا وهبوطا لكل تخفيف. في النهاية، كل صف سوف تحتوي على تخفيف المسلسل 10 أضعاف من الخليط الأولي.استخدام ماصة متعددة القنوات مزودة ثماني نصائح لpirate خمسة ميكروليترس من كل بئر في سلسلة التخفيف وبقعة على لوحة LBS agar الملحقة LBS التي تحدد للذرة المرجعية. كرر هذه الخطوة لتحديد سلالات منافس اكتشاف على لوحة المكملة كلورافينيكول. بعد أن جفت البقع تماما، ضع لوحات في الحاضنة في 24 درجة مئوية.بعد بقع التراكم المعدنية ولوحات 24 جيدا قد احتضنت لمدة خمس ساعات في 24 درجة مئوية، إضافة ملليلتر واحد من مرق LBS إلى كل بئر. Resuspend بواسطة pipetting صعودا وهبوطا حتى تم resuspended جميع الخلايا كونها متسقة مع النشاط الذي يتم إعادة تعليق الخلايا عبر جميع النسخ المتماثل. مرة واحدة يتم إعادة تعليق كل بقعة coincubation، وإعداد لوحة 96 جيدا لتخفيف المسلسل وألواح أجار LBS مع المضادات الحيوية المناسبة التي على الفور التخفيف بنفس الطريقة كما فعلت سابقا.لإكمال التخفيف التسلسلي للقياسات النهائية t في 24 ألواح البئر، تنفيذ الخطوات المستخدمة لتخفيف المسلسل من inoculum البداية وبقعة كل تخفيف على لوحات Agar LBS كما فعلت سابقا. المضي قدما في تصوير بقع النتوء على لوحات بيتري وتحليل البيانات كما هو موضح في المخطوطة. في المعالجة تجريبيّة, ال [ا لّورّدّيّددد], واحدة موجودة في نسبة من 0.5 في البداية ونهاية من التجربة متّسقة مع التحكم معالجة.لم تكن قيم RCI للسجل مختلفة إحصائياً عن الصفر لمعالجة التحكم أو عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس واحد. وتشير هذه البيانات إلى أنه لم تكن هناك منافسة بين السلالة المرجعية والضغط المنافس واحد. وعلى النقيض من ذلك، عندما كانت السلالة المرجعية محتضنة بسلالات المنافسين الثانية، انخفضت السلالة المرجعية من نسبة 0.5 في البداية إلى نسبة أقل من 0.01 في نهاية التجربة.وعلاوة على ذلك، كانت قيم السجل RCI أكبر بكثير من الصفر عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافسين اثنين. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن نسبة السلالة المرجعية انخفضت في وجود إجهاد منافسين اثنين مما يشير إلى وجود منافسة بين السلالات. عندما تم احتضان السلالة المرجعية مع سلالة المنافس الأول ، زادت وحدات CFUs من كل من السلالات على مدار خمس ساعات ولم تكن مختلفة بشكل كبير مما يشير إلى أنه لم تحدث منافسة.أيضا, تقريبا 3200٪ لوحظت الانتعاش الذي لم يكن مختلفا إحصائيا عن عنصر التحكم. ومع ذلك، عندما تم احتضان سلالة مرجعية مع سلالة المنافس الثاني، سلالة المرجعية CFUs كانت أقل بكثير من سلالة اثنين من وحدات CFUs في السيطرة في خمس ساعات. أيضا، لوحظت تقريبا 4٪ انتعاش بشكل ملحوظ أقل من عنصر التحكم.وإجمالاً، تشير هذه البيانات إلى أن سلالة اثنين من أصل تنافست السلالة المرجعية عن طريق قتل خلاياها. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو تحقيق نسبة البداية الصحيحة لأنها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

استعمار Euprymna scolopes الحبار بواسطة الضمة fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

تطوير أكثر حساسية وخصوصية اللونية آجار المتوسطة للكشف عن<em&gt; الضمة نظيرة الحالة للدم</em&gt; وغيره<em&gt; الضمة</em&gt; الأنواع

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

تقنيات المختبر تستخدم للحفاظ على والتمايز بيوتيبس<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; العوازل السريرية والبيئية

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

تحريض التمايز الخلوي والتصوير خلية واحدة من<em&gt; فيبرايو بارايموليتيكوس</em&gt; السباح و سوارمر الخلايا

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

التحديد الكمي لاستعمار الكوليرا والإسهال في النموذج الزرد الكبار

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...