Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Vi vil gerne takke anmeldere for deres nyttige feedback. A.N.S. blev støttet af Gordon og Betty Moore Foundation gennem Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.

1. Forbered stammer til Coinkubation
<ol><li>Vælg en passende referencestamme, der vil tjene som mål for bakteriel konkurrence under coinkukation assay. Se diskussionen om bedste praksis, når du vælger en referencestamme, og hvordan reference stammen vil påvirke resultaterne. I denne protokol vil V. Stormhat Strain ES114 tjene som referencestamme.</li>
	<li>
Afgøre, hvilke udvælgelses-og screeningsmetoder der vil blive anvendt til at skelne mellem isolaterne i coinkubation</stro...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Den coinkubations analyse, der er beskrevet ovenfor, giver en effektiv metode til at opdage interbakteriel konkurrence. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at identificere den intraspecifikke konkurrence mellem V. Stormhat isolater og karakteriseringen af konkurrence mekanismen19. Selv om den beskrevne metode blev optimeret til marine bakterien V. Stormhat, det kan nemt ændres til at rumme andre bakterielle arter, herunder kliniske og miljømæssige isolater. Det er vigtigt a...

Dette manuskript skitserer en kultur-baseret metode til at afgøre, om to bakterielle isolater er i stand til konkurrencemæssige interaktioner. Når man studerer blandede populationer, er det vigtigt at vurdere, i hvilket omfang de bakterielle isolater interagerer, især om isolater konkurrerer direkte gennem interferens mekanismer. Interferens konkurrence refererer til interaktioner, hvor en population direkte hæmmer væksten eller dræber en konkurrent befolkning1. Disse interaktioner er vigtige at identificere, fordi de kan have dybtgående virkninger på en mikrobiel samfund struktur og funktion2,3.
Mekanismer for mikrobiel konkurrence er blevet opdaget bredt i genomer af bakterier fra forskellige miljøer, herunder både værts-associerede og frie levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En række forskellige konkurrencestrategier er blevet beskrevet10,11 herunder difsible mekanismer, såsom bakteriedræbende kemikalier1,12 og udskillet antimikrobielle peptider13 , samt kontaktafhængige mekanismer, der kræver celle celle kontakt for at overføre en hæmmende Effector til målcellerne9,14,15,16,17 ,18.
Selv om kulturbaserede coinkubationer almindeligvis anvendes i mikrobiologi5,8,19, skitserer dette manuskript, hvordan man bruger analysen til at karakterisere konkurrence mekanismen, samt forslag til tilpasning protokollen til brug sammen med andre bakteriearter. Desuden beskriver denne metode flere tilgange til at analysere og præsentere dataene for at besvare forskellige spørgsmål om karakteren af de konkurrencemæssige interaktioner. Selv om de teknikker, der er beskrevet her, tidligere blev anvendt til at identificere den interbakterielle dræbende mekanisme underliggende intraspecifik konkurrence mellem symbiotiske stammer af coisolerede Vibrio Stormhat bakterier19, er de velegnede til mange bakteriearter, herunder miljø isolater og humane patogener, og kan udnyttes til at evaluere både kontaktafhængige og difsible konkurrencemekanismer. Trin i protokollen kan kræve optimering for andre bakteriearter. Da flere modelsystemer udvider deres studier ud over brugen af isogene organismer til at omfatte forskellige genotyper10,16,20,21, vil denne metode være en værdifuld ressource for forskere, som søger at forstå, hvordan konkurrencen påvirker systemer med flere belastninger eller flere arter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Dette manuskript beskriver en kultur baseret, coinkubations analyse til påvisning og karakterisering af konkurrencemæssige interaktioner mellem to bakterie populationer. Denne metode anvender stabile plasmider, som gør det muligt for hver population at blive differentielt mærket med forskellige antibiotikaresistens kapaciteter og fluorescerende proteiner til udvælgelse og visuel diskrimination af hver population, hhv. Her beskriver vi forberedelsen og coinkubationen af konkurrerende Vibrio Stormhat -stammer, Fluorescens mikroskopi Imaging og kvantitativ dataanalyse. Denne fremgangsmåde er enkel, giver hurtige resultater, og kan bruges til at afgøre, om en population dræber eller hæmmer væksten i en anden population, og om konkurrencen er medieret gennem et diffusible molekyle eller kræver direkte celle celle kontakt. Fordi hver bakteriepopulation udtrykker et andet fluorescerende protein, tillader analysen den geografiske diskrimination af konkurrerende populationer i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metoder udføres med symbiotisk bakterie V. Stormhat ved hjælp af betingelser, der er optimeret til denne art, kan protokollen tilpasses for de fleste bestemmelse antal kimtal bakteriel isolater.

For at vurdere den konkurrencemæssige interaktion mellem bakterie populationer blev der udviklet en coinkubations analyse protokol, som blev optimeret til V. Stormhat. Denne metode udnytter stabile plasmider at indkode antibiotikaresistensgener og fluorescerende proteiner, giver mulighed for differentiel udvælgelse og visuel diskrimination af hver stamme. Ved at analysere de data, der indsamles fra coinkubations analysen, kan det konkurrencemæssige resultat af en interaktion o...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bakterier indkode forskellige mekanismer til at engagere sig i interbakteriel konkurrence. Her præsenterer vi en kultur baseret protokol til karakterisering af konkurrence interaktioner mellem bakterielle isolater, og hvordan de påvirker den rumlige struktur af en blandet befolkning.

Coinkubations analyse til kvantificering af konkurrence interaktioner mellem Vibrio Stormhat isolater

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Vores protokol giver en enkel, men robust tilgang til at identificere og karakterisere konkurrencemekanismer mellem forskellige stammer af Vibrio fischeri bakterier. Denne metode bruger stabile plasmider, der koder forskellige antibiotikaresistens gener og fluorescerende proteiner, der giver mulighed for differentieret udvælgelse og visuel diskrimination af hver bakteriestamme i en blandet kultur. Til at begynde, bruge en steril tandstikker til at skrabe cellerne fra agar plade i størrelsen af et riskorn.Resuspend cellerne i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, der indeholder en milliliter LBS bouillon. For at bryde celleklumperne op skal du trykke dem ind i siden af røret og derefter pipette kraftigt op og ned. Rør og vortex lukkes i et til to sekunder, og hvis celleklumperne stadig er synlige, indtil prøven er visuelt ensartet.Gentag disse forberedelsestrin fra celleskrabning til vortexing for alle prøver. Den optiske massetæthed måles og registreres ved 600 nanometer for alle prøver. For at opnå en nøjagtig OD-måling skal prøverne fortyndes op til 10 gange med LBS bouillon.Derefter normalisere hver prøve til den ønskede OD 600. For at blande referencestammen og konkurrentstammen i et forhold på en til en skal der tilsættes 100 mikroliter af hver stamme, der normaliseres, til OD 1,0 til et mærket 1,5 millilitercentrifugerør og vortex i et til to sekunder. Som en kontrol, bland referencestammen med en differentieret mærket version af sig selv og vortex så godt.Det er afgørende at opnå det korrekte startforhold, da det kan ændre eksperimentets udfald betydeligt. For at sikre succes kan dette trin kræve optimering for en given bakterieart. Efter at have gentaget dette trin for hver biologisk replikat bør der være fire biologiske replikater med differentierede referencestammer som kontroller og fire biologiske replikater med differentieret mærkede reference- og konkurrentstammer.For at gøre kultur pletter, der vil blive brugt til fluorescens mikroskopi efter inkubationen, tilsæt 10 mikroliter af hver kontrol og eksperimentel blanding på en petriplade, der indeholder LBS agar. Efter pletterne er helt tørret på bænken, inkubere pladerne ved 24 grader Celsius i 24 timer. For at gøre kultur pletter, der vil blive brugt til at kvantificere kolonien danner enheder for hver stamme i slutningen af forsøget, tilføje 10 mikroliter af hver kontrol og eksperimentelle blandinger i 24 brøndplader, der indeholder en milliliter LBS agar per brønd.Efter pletterne er helt tørret, inkubere pladerne ved 24 grader Celsius i fem timer. For at udføre en seriel fortynding af startmønterblandinger, skal du rotere en 96 brøndplade 90 grader, så der er otte kolonner og 12 rækker. Mærl hver række med stamme-id'et, replikertallet og det tidspunkt, der starter med t nul.Mærl LBS agar plader suppleret med passende antibiotikum, som at få øje på fortynding serien og samtidig sørge for at identificere, hvilken stamme hver antibiotikaplade vælger til. Med en multi-kanal pipette, tilføje 180 mikroliter LBS bouillon til hver brønd forlader den første kolonne tom for ufortyndet møntindpububation blanding. Ved hjælp af en 200 mikroliter enkelt kanal pipette, overføre 100 mikroliter af coincubation blandingen fra røret til den første brønd i den første kolonne, derefter kassere spidsen og gentag for alle coincubation blandinger.Med en pipette med flere kanaler overføres 20 mikroliter fra kolonne et til kolonne to og pipette op og ned for at blande. Kassér spidserne og gentag for hver kolonne, samtidig med at de er i overensstemmelse med antallet af pipettering op og ned for hver fortynding. Ved udgangen vil hver række indeholde en 10-fold seriel fortynding af den oprindelige blanding.Brug en flerkanalspipette udstyret med otte spidser til at aspirere fem mikroliter fra hver brønd i en fortyndingsserie og spot på Kanamycin suppleret LBS agar plade, der vælger for referencestammen. Gentag dette trin for at vælge for konkurrenten stamme spotting på Chloramphenicol suppleret plade. Når pletterne er tørret helt, skal pladerne i inkubatoren sættes på 24 grader Celsius.Efter møntpubationspletter og de 24 brøndplader er blevet inkuberet i fem timer ved 24 grader Celsius, tilsættes en milliliter LBS bouillon til hver brønd. Resuspenderet ved pipettering op og ned, indtil alle celler er blevet resuspenderet være i overensstemmelse med den kraft, hvori cellerne er resuspended på tværs af alle replikater. Når hvert møntklapningssted er opsuspendret igen, forberedes en 96 brøndplade til en seriel fortynding og LBS-agarplader med de relevante antibiotika, som fortyndingen skal spottes på samme måde som tidligere gjort.For at fuldende den serielle fortynding til t endelige målinger i de 24 brøndplader udføres trin, der anvendes til den serielle fortynding af startinokulum, og hver fortynding på LBS-agarplader som udført tidligere. Fortsæt med at aflyde møntpubationsplyngerne på petripladerne og dataanalysen som beskrevet i manuskriptet. I forsøgsbehandlingen er den ene referencestamme og konkurrentstamme til stede med en andel på 0,5 i begyndelsen og slutningen af forsøget i overensstemmelse med kontrolbehandlingen.Log RCI-værdierne var ikke statistisk forskellige fra nul for kontrolbehandlingen, eller når referencestammen blev inkuberet med konkurrentstamme 1. Disse oplysninger tyder på, at der ikke var nogen konkurrence mellem referencebelastningen og konkurrentens belastning. Da referencestammen derimod blev inkuberet med konkurrentstamme to, faldt referencestammen fra en andel på 0,5 ved begyndelsen til en andel på under 0,01 ved forsøgets afslutning.Desuden var log RCI-værdierne betydeligt større end nul, når referencestammen blev inkuberet med konkurrentstamme to. Tilsammen tyder disse data på, at andelen af referencebelastningen faldt i tilfælde af konkurrent, der tyder konkurrencen mellem stammerne. Da referencebelastningen blev inkuberet med konkurrentstamme et, steg CFUs af begge stammer i løbet af fem timer og var ikke væsentligt forskellige, hvilket tyder på, at der ikke var nogen konkurrence.Der blev også observeret ca. 3200 % bedring, som ikke var statistisk forskellig fra styringskontrollen. Da referencestammen imidlertid blev inkuberet med konkurrentstamme to, var referencestammens CFUs betydeligt lavere end stamme to CFUs i kontrollen efter fem timer. Desuden blev ca. 4% opsving observeret betydeligt lavere end kontrollen.Alt i alt tyder disse data på, at stamme to ud konkurrerede referencestammen ved at dræbe sine celler. Det vigtigste skridt i denne procedure er at opnå det korrekte startforhold, da det kan påvirke resultaterne betydeligt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Kolonisering af Euprymna scolopes Squid ved Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model for at studere samspillet mellem humant fuldblod og Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering af effekt og toksicitet af RNA Målretning HIV-1 Produktion til brug i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Udvikling af en mere følsom og specifik Chromogenic Agar Medium til detektion af<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Og Andet<em&gt; Vibrio</em&gt; Arter

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratorieteknikker anvendt til at opretholde og differentiere biotyper af<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Kliniske og miljømæssige isolater

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induktion af celledifferentiering og single cell imaging af<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Svømmer og sværmerceller

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion af menneskelige lymfoide væv og kvindelige kønsorganer slimhinde med Human immundefekt Virus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Kvantificering af Vibrio cholerae kolonisering og diarré i den voksne zebrafisk Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...