Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
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Nous tenons à remercier les évaluateurs pour leurs commentaires utiles. A.N.S. a reçu le soutien de la Fondation Gordon et Betty Moore par l'entremise de Grant GBMF 255.03 à la Life Sciences Research Foundation.

1. Préparer des souches pour la coincubation
<ol><li>Choisissez une souche de référence appropriée qui servira de cible pour la compétition bactérienne pendant l'épreuve de coincubation. Voir Discussion pour les meilleures pratiques lors de la sélection d'une souche de référence et comment la souche de référence aura un impact sur les résultats. Dans ce protocole, la souche V. fischeri ES114 servira de souche de référence.</li>
	<li>
Déterminer quelles méthodes de sél...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Le résultat coincubation décrit ci-dessus fournit une méthode puissante pour découvrir la concurrence interbactérienne. Cette approche a permis d'identifier la concurrence intraspécifique entre les isolats de V. fischeri et de caractériser le mécanisme concurrentiel19. Bien que la méthode décrite ait été optimisée pour la bactérie marine V. fischeri, elle peut être facilement modifiée pour accueillir d'autres espèces bactériennes, y compris des isolats cliniques...

Ce manuscrit décrit une méthode basée sur la culture pour déterminer si deux isolats bactériens sont capables d'interactions concurrentielles. Lors de l'étude des populations mixtes, il est important d'évaluer dans quelle mesure les isolats bactériens interagissent, en particulier si les isolats sont directement en concurrence par des mécanismes d'interférence. La concurrence d'interférence se rapporte aux interactions où une population inhibe directement la croissance ou tue une population concurrente1. Ces interactions sont importantes à identifier car elles peuvent avoir des effets profonds sur la structure et la fonction d'une communauté microbienne2,3.
Des mécanismes de concurrence microbienne ont été découverts largement dans les génomes de bactéries provenant d'environnements divers, y compris les bactéries associées à l'hôte et les bactéries vivant librement4,5,6,7, 8,9. Diverses stratégies de concurrence ont été décrites10,11 comprenant des mécanismes diffusibles, tels que les produits chimiques bactéricides1,12 et les peptides antimicrobiens sécrétés13 , ainsi que les mécanismes dépendants du contact qui nécessitent un contact cellule-cellule pour transférer un effecteur inhibiteur dans les cellules cibles9,14,15,16,17 ,18.
Bien que les coincubations basées sur la culture soient couramment utilisées en microbiologie5,8,19, ce manuscrit décrit comment utiliser le résultat pour caractériser le mécanisme de la concurrence, ainsi que des suggestions pour adapter protocole d'utilisation avec d'autres espèces bactériennes. En outre, cette méthode décrit de multiples approches pour analyser et présenter les données pour répondre à différentes questions sur la nature des interactions concurrentielles. Bien que les techniques décrites ici aient été utilisées précédemment pour identifier le mécanisme de mise à mort interbactérienne sous-jacent à la concurrence intraspécifique entre les souches symbiotiques des bactéries coisolées de Vibrio fischeri 19,elles conviennent de nombreuses espèces bactériennes, y compris les isolats environnementaux et les agents pathogènes humains, peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes concurrentiels dépendants du contact et les mécanismes de concurrence diffusibles. Les étapes du protocole peuvent nécessiter une optimisation pour d'autres espèces bactériennes. Étant donné que plus de systèmes modèles élargissent leurs études au-delà de l'utilisation d'organismes isogéniques pour inclure différents génotypes10,16,20,21, cette méthode sera une ressource précieuse chercheurs qui cherchent à comprendre comment la concurrence a un impact sur les systèmes multi-souches ou multi-espèces.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Ce manuscrit décrit un test de coincubation fondé sur la culture pour détecter et caractériser les interactions concurrentielles entre deux populations bactériennes. Cette méthode utilise des plasmides stables qui permettent à chaque population d'être étiquetée différemment avec des capacités distinctes de résistance aux antibiotiques et des protéines fluorescentes pour la sélection et la discrimination visuelle de chaque population, respectivement. Ici, nous décrivons la préparation et la coincubation des souches concurrentes de Vibrio fischeri, l'imagerie par microscopie de fluorescence et l'analyse quantitative des données. Cette approche est simple, donne des résultats rapides, et peut être utilisée pour déterminer si une population tue ou inhibe la croissance d'une autre population, et si la concurrence est négociée par une molécule diffusible ou nécessite un contact direct cellule-cellule. Parce que chaque population bactérienne exprime une protéine fluorescente différente, l'épreuve permet la discrimination spatiale des populations concurrentes au sein d'une colonie mixte. Bien que les méthodes décrites soient effectuées avec la bactérie symbiotique V. fischeri en utilisant des conditions optimisées pour cette espèce, le protocole peut être adapté pour la plupart des isolats bactériens culturables.

Afin d'évaluer les interactions concurrentielles entre les populations bactériennes, un protocole d'analyse de coincubation a été développé et optimisé pour V. fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent les gènes de résistance aux antibiotiques et les protéines fluorescentes, permettant une sélection différentielle et la discrimination visuelle de chaque souche. En analysant les données recueillies à partir de l'analyse de coincubation, le ré...

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Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Les bactéries encodent divers mécanismes pour s'engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d'une population mixte.

Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Notre protocole fournit une approche simple mais robuste pour identifier et caractériser les mécanismes concurrentiels entre les différentes souches de bactéries Vibrio fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent différents gènes de résistance aux antibiotiques et protéines fluorescentes qui permettent une sélection différentielle et une discrimination visuelle de chaque souche bactérienne dans une culture mixte. Pour commencer, utilisez un cure-dent stérile pour gratter les cellules de la plaque d’agar de la taille d’un grain de riz.Resuspendez les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de bouillon LBS. Pour briser les touffes cellulaires, appuyez-les sur le côté du tube, puis pipette de haut en bas vigoureusement. Fermez le tube et le vortex pendant une à deux secondes et répétez si les touffes de cellules sont encore visibles jusqu’à ce que l’échantillon soit visuellement uniforme.Répétez ces étapes de préparation, du grattage cellulaire au vortex pour tous les échantillons. Mesurez et enregistrez la densité optique à 600 nanomètres pour tous les échantillons. Pour obtenir une mesure précise de la DO, diluer les échantillons jusqu’à 10 fois à l’aide du bouillon LBS.Ensuite, normalisez chaque échantillon à l’OD 600 désiré. Pour mélanger la souche de référence et la souche concurrente dans un rapport un à un, ajouter 100 microlitres de chaque souche normalisée à OD 1.0 à un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté et vortex pendant une à deux secondes. Comme un contrôle, mélanger la souche de référence avec une version marquée différentielle de lui-même et vortex ainsi.Il est essentiel d’atteindre le bon rapport de départ car il peut considérablement changer le résultat de l’expérience. Pour assurer le succès, cette étape peut nécessiter une optimisation pour une espèce bactérienne donnée. Après avoir répété cette étape pour chaque réplique biologique, il devrait y avoir quatre répliques biologiques avec des souches de référence marquées différemment comme témoins et quatre répliques biologiques avec des souches de référence et de concurrents marquées différemment.Pour créer des taches de culture qui seront utilisées pour la microscopie par fluorescence après l’incubation, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange de contrôle et expérimentaux sur une plaque de Petri contenant de l’agar LBS. Après que les taches ont complètement séché sur le banc, couver les plaques à 24 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour créer des taches de culture qui seront utilisées pour quantifier les unités de formation de la colonie pour chaque souche à la fin de l’expérience, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange de contrôle et expérimentaux en 24 plaques de puits contenant un millilitre d’agar LBS par puits.Une fois les taches complètement séchées, incuber les plaques à 24 degrés Celsius pendant cinq heures. Pour effectuer une dilution en série des mélanges de cocubation de départ, faites pivoter une plaque de puits de 96 degrés de sorte qu’il y ait huit colonnes et 12 rangées. Étiquetez chaque ligne avec l’ID de contrainte, le numéro de répétition, et le temps commençant par t zéro.Étiquetez les plaques d’agar LBS complétées par l’antibiotique approprié sur lequel repérer la série de dilution tout en s’assurant d’identifier la souche pour laquelle chaque plaque antibiotique sélectionne. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 180 microlitres de bouillon LBS à chaque puits, laissant la première colonne vide pour le mélange de cocubation non dilué. À l’aide d’une pipette à canal unique de 200 microlitres, transférer 100 microlitres du mélange de co-incubation du tube vers le premier puits de la première colonne, puis jeter la pointe et répéter pour tous les mélanges de cocubation.Avec une pipette multicanal, transférer 20 microlitres de la colonne un à la colonne deux et pipette de haut en bas pour mélanger. Jetez les pointes et répétez pour chaque colonne tout en étant compatible avec le nombre de pipetting de haut en bas pour chaque dilution. À la fin, chaque rangée contiendra une dilution en série 10 fois du mélange initial.Utilisez une pipette multicanal munie de huit pointes pour aspirer cinq microlitres de chaque puits dans une série de dilution et repérer sur la plaque d’agar LBS complétée par Kanamycin qui sélectionne pour la souche de référence. Répétez cette étape pour sélectionner pour la souche concurrente spotting sur la plaque complétée chloramphénicol. Une fois les taches complètement séchées, placez les plaques dans l’incubateur à 24 degrés Celsius.Après que les taches de cocubation et les 24 plaques de puits ont été incubées pendant cinq heures à 24 degrés Celsius, ajoutez un millilitre de bouillon LBS à chaque puits. Resuspendez en pipetage de haut en bas jusqu’à ce que toutes les cellules ont été résuspendus étant compatible avec la vigueur dans laquelle les cellules sont résuspendées à travers toutes les répliques. Une fois que chaque point de co-incubation est réutilisé, préparer une plaque de puits 96 pour une dilution en série et des plaques d’agar LBS avec les antibiotiques appropriés sur lesquels repérer la dilution de la même manière que précédemment fait.Pour compléter la dilution en série pour les mesures finales t dans les 24 plaques de puits, effectuer des étapes utilisées pour la dilution en série de l’inoculum de départ et repérer chaque dilution sur les plaques d’agar LBS comme cela a été fait précédemment. Procédez à l’imagerie des taches de cocubation sur les plaques Petri et à l’analyse des données décrites dans le manuscrit. Dans le traitement expérimental, la souche de référence et la souche concurrente une souche sont présentes à une proportion de 0,5 au début et à la fin de l’expérience compatible avec le traitement de contrôle.Les valeurs RCI du journal n’étaient pas statistiquement différentes de zéro pour le traitement de contrôle ou lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente 1. Ces données suggèrent qu’il n’y avait pas de concurrence entre la souche de référence et la souche concurrente. En revanche, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux, la souche de référence est passé d’une proportion de 0,5 au début à une proportion inférieure à 0,01 à la fin de l’expérience.De plus, les valeurs rci des grumes étaient significativement supérieures à zéro lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux. Ensemble, ces données indiquent que la proportion de la souche de référence a diminué en présence de la souche concurrente deux suggérant la concurrence entre les souches. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente 1, les FC des deux souches ont augmenté au cours de cinq heures et n’étaient pas significativement différentes, ce qui donne à penser qu’aucune concurrence ne s’est produite.De plus, on a observé une récupération d’environ 3 200 %, ce qui n’était pas statistiquement différent du contrôle. Toutefois, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux, les CFC de souche de référence étaient significativement inférieurs à la souche deux FC dans le contrôle à cinq heures. En outre, environ 4% de récupération a été observé sensiblement inférieur au contrôle.Au total, ces données indiquent que la souche deux sur concurrencé la souche de référence en tuant ses cellules. L’étape la plus importante dans cette procédure est d’atteindre le bon rapport de départ car il peut avoir un impact significatif sur les résultats.

Research

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Immunology and Infection

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