Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Wir danken den Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback. A.N.S. wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation durch Grant GBMF 255.03 an die Life Sciences Research Foundation unterstützt.

1. Bereiten Sie Stämme für die Coinkubation vor
<ol><li>Wählen Sie einen geeigneten Referenzstamm, der als Ziel für den bakteriellen Wettbewerb während des Coinkubationstestes dient. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion über bewährte Methoden bei der Auswahl eines Referenzstamms und darüber, wie sich der Referenzstamm auf die Ergebnisse auswirkt. In diesem Protokoll dient der V. fischeri-Stamm ES114 als Referenzstamm.</li>
	<li>
Bestimmen, welche Selektions- und Sc...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus19. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate ...

Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet1. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft haben können2,3.
Mechanismen für mikrobielle Konkurrenz wurden weit in Genomen von Bakterien aus verschiedenen Umgebungen entdeckt, einschließlich sowohl wirtassoziierter als auch freilebender Bakterien4,5,6,7, 8,9. Eine Vielzahl von Wettbewerbsstrategien wurden beschrieben10,11 einschließlich diffusible Mechanismen, wie bakterizide Chemikalien1,12 und abgesonderte antimikrobielle Peptide13 , sowie kontaktabhängige Mechanismen, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordern, um einen hemmenden Effektor in die Zielzellen9,14,15,16,17 zu übertragen ,18.
Obwohl kulturbasierte Coinkubationen häufig in der Mikrobiologie5,8,19verwendet werden, skizziert dieses Manuskript, wie der Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, sowie Vorschläge zur Anpassung das Protokoll für die Verwendung mit anderen Bakterienarten. Darüber hinaus beschreibt diese Methode mehrere Ansätze zur Analyse und Darstellung der Daten, um verschiedene Fragen zur Art der Wettbewerbsinteraktionen zu beantworten. Obwohl die hier beschriebenen Techniken zuvor verwendet wurden, um den interbakteriellen Tötungsmechanismus zu identifizieren, der dem intraspezifischen Wettbewerb zwischen symbiotischen Stämmen von koisolierten Vibrio fischeri-Bakterien19zugrunde liegt, eignen sie sich viele Bakterienarten, einschließlich Umweltisolate und menschliche Krankheitserreger, und können verwendet werden, um sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Wettbewerbsmechanismen zu bewerten. Schritte im Protokoll erfordern möglicherweise eine Optimierung für andere Bakterienarten. Angesichts der Tatsache, dass mehr Modellsysteme ihre Studien über die Verwendung isogener Organismen hinaus erweitern, um verschiedene Genotypen10,16,20,21, wird diese Methode eine wertvolle Ressource sein für Forscher, die verstehen wollen, wie sich der Wettbewerb auf Multi-Stamm- oder Multi-Arten-Systeme auswirkt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.

Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterienpopulationen zu bewerten, wurde ein Coinkubations-Assay-Protokoll entwickelt und für V. fischerioptimiert. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, was eine Differenzauswahl und visuelle Diskriminierung jedes Stammes ermöglicht. Durch die Analyse der Daten, die aus dem Coincubation-Test gesammelt wurden, können das Wettbewerbsergebnis einer Interaktion und der Mechani...

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Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Unser Protokoll bietet einen einfachen, aber robusten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von Wettbewerbsmechanismen zwischen verschiedenen Stämmen von Vibrio fischeri Bakterien. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die verschiedene Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, die eine differenzierte Auswahl und visuelle Diskriminierung jedes Bakterienstamms in einer gemischten Kultur ermöglichen. Um zu beginnen, verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um die Zellen von der Agarplatte in der Größe eines Reiskorns zu kratzen.Setzen Sie die Zellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einem Milliliter LBS-Brühe wieder aus. Um die Zellklumpen aufzubrechen, drücken Sie sie in die Seite des Rohres und dann Pipette nach oben und unten kräftig. Schließen Sie die Röhre und den Wirbel für ein bis zwei Sekunden, und wiederholen Sie, wenn die Zellklumpen noch sichtbar sind, bis die Probe visuell einheitlich ist.Wiederholen Sie diese Vorbereitungsschritte vom Zellabkratzen bis zum Wirbeln für alle Proben. Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern für alle Proben. Um eine genaue OD-Messung zu erhalten, verdünnen Sie die Proben bis zu 10-fach mit LBS-Brühe.Normalisieren Sie dann jede Probe auf den gewünschten OD 600. Um die Referenzdehnung und die Konkurrenzdehnung in einem Verhältnis von eins zu eins zu mischen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder zu OD 1.0 normalisierten Sorte zu einem beschrifteten 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und Wirbel für ein bis zwei Sekunden hinzu. Mischen Sie als Steuerung die Referenzdehnung mit einer differenziell getaggten Version von sich selbst und Wirbel.Es ist entscheidend, das richtige Startverhältnis zu erreichen, da es das Ergebnis des Experiments erheblich verändern kann. Um den Erfolg zu gewährleisten, kann dieser Schritt eine Optimierung für eine bestimmte Bakterienart erfordern. Nach der Wiederholung dieses Schritts für jede biologische Replikation sollte es vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenzstämmen als Kontrollen und vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenz- und Mitbewerberstämmen geben.Um Kulturflecken zu schaffen, die nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, fügen Sie 10 Mikroliter jeder Kontroll- und Versuchsmischung auf eine Petriplatte mit LBS-Agar ein. Nachdem die Flecken auf der Bank vollständig getrocknet sind, bebrüten die Teller 24 Stunden lang bei 24 Grad Celsius. Um Kulturflecken zu schaffen, die verwendet werden, um die Koloniebildenden Einheiten für jeden Stamm am Ende des Experiments zu quantifizieren, fügen Sie 10 Mikroliter jeder Steuerung und experimentelle Mischungen in 24 Brunnenplatten ein, die einen Milliliter LBS-Agar pro Brunnen enthalten.Nachdem die Flecken vollständig getrocknet sind, bebrüten die Teller bei 24 Grad Celsius für fünf Stunden. Um eine serielle Verdünnung von Beginnen coinkubationsmischungen durchzuführen, drehen Sie eine 96 Wellplatte um 90 Grad, so dass es acht Spalten und 12 Reihen gibt. Beschriften Sie jede Zeile mit der Stamm-ID, der Replikationsnummer und der Zeit, die mit t Null beginnt.Etikettieren Sie die LBS-Agarplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, um die Verdünnungsserie zu erkennen, und stellen Sie sicher, dass sie feststellen, für welchen Stamm jede Antibiotikaplatte ausgewählt wird. Mit einer Mehrkanalpipette 180 Mikroliter LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzufügen und die erste Säule für die unverdünnte Coinkubationsmischung leer lassen. Mit einer 200-Mikroliter-Einkanalpipette 100 Mikroliter des Coinkubationsgemisches vom Rohr auf den ersten Brunnen der ersten Kolonne übertragen, dann die Spitze entsorgen und für alle Coinkubationsmischungen wiederholen.Mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter von Spalte eins auf Spalte zwei und Pipette nach oben und unten übertragen, um sie zu mischen. Verwerfen Sie die Spitzen, und wiederholen Sie für jede Spalte, während sie mit der Anzahl der Pipetten nach oben und unten für jede Verdünnung konsistent ist. Am Ende enthält jede Zeile eine 10-fache serielle Verdünnung der ursprünglichen Mischung.Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette mit acht Spitzen, um fünf Mikroliter aus jedem Brunnen in einer Verdünnungsserie zu aspirieren und auf die Kanamycin ergänzte LBS Agarplatte zu erkennen, die für die Referenzdehnung ausgewählt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt, um für die Konkurrenz-Dehnungssuche auf der Chloramphenicol-Ergänzungsplatte auszuwählen. Nachdem die Flecken vollständig getrocknet sind, legen Sie die Teller bei 24 Grad Celsius in den Brutkasten.Nachdem die Coinkubationsstellen und die 24 Brunnenplatten fünf Stunden lang bei 24 Grad Celsius inkubiert wurden, fügen Sie jedem Brunnen jeweils einen Milliliter LBS-Brühe hinzu. Resuspendieren Sie durch Pipettieren nach oben und unten, bis alle Zellen resuspendiert wurden, da sie mit der Kraft übereinstimmen, in der die Zellen über alle Replikationen resuspendiert werden. Sobald jeder Coinkubationspunkt resuspendiert ist, bereiten Sie eine 96-Well-Platte für eine serielle Verdünnung und LBS-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika vor, auf denen die Verdünnung auf die gleiche Weise wie zuvor zu erkennen ist.Um die serielle Verdünnung für t-Endmessungen in den 24 Wellplatten abzuschließen, führen Sie Schritte zur seriellen Verdünnung des Startinokulums durch und erkennen Sie jede Verdünnung auf LBS-Agarplatten wie bisher. Fahren Sie mit der Abbildung der Coinkubationsflecken auf den Petriplatten und der Datenanalyse fort, wie im Manuskript beschrieben. Bei der experimentellen Behandlung sind der Referenzstamm und der Konkurrenzstamm 1 zu Beginn und am Ende des Experiments im Einklang mit der Kontrollbehandlung bei einem Anteil von 0,5 vorhanden.Die Log-RCI-Werte unterschieden sich statistisch nicht von Null für die Kontrollbehandlung oder wenn der Referenzstamm mit Demierstamm eins inkubiert wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass es keinen Wettbewerb zwischen der Referenzbelastung und der Konkurrenzbelastung gab. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Referenzstamm von einem Anteil von 0,5 zu Beginn auf einen Anteil von weniger als 0,01 am Ende des Experiments, als der Referenzstamm mit dem Wettbewerberstamm zwei inkubiert wurde.Darüber hinaus waren die Log-RCI-Werte deutlich größer als Null, wenn der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm zwei inkubiert wurde. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass der Anteil der Referenzspannung in Gegenwart von Wettbewerberstamm zwei abnahm, was auf einen Wettbewerb zwischen den Stämmen hindeutet. Als der Referenzstamm mit der Konkurrenzsorte 1 inkubiert wurde, nahmen die KBE beider Stämme im Laufe von fünf Stunden zu und unterschieden sich nicht wesentlich, was darauf hindeutet, dass es zu keinem Wettbewerb kam.Außerdem wurde eine Erholung von ca. 3200% beobachtet, die sich statistisch nicht von der Kontrolle unterscheidet. Wenn jedoch der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm zwei inkubiert wurde, waren die Referenzstamm-KBE mit fünf Stunden deutlich niedriger als die Vonspannung zwei KBE in der Kontrolle. Außerdem wurde eine Erholung von ca. 4% deutlich niedriger beobachtet als die Kontrolle.Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass Stamm zwei den Referenzstamm durch Dasabtöten seiner Zellen konkurrierten. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist das Erreichen des richtigen Startverhältnisses, da es die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

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Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

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Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

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The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

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Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

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Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

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Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

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Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

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Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

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Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...