Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

ברצוני להודות לבודקים על המשוב המועיל שלהם. A.N.S. היתה נתמכת על ידי קרן גורדון ובטי מור באמצעות גרנט GBMF 255.03 לקרן המחקר למדעי החיים.

1. להכין זנים עבור Coincubation
<ol><li>לבחור זן התייחסות מתאים שישמש כיעד לתחרות חיידקים במהלך שיטת הדגירה. ראה דיון לגבי שיטות עבודה מומלצות בעת בחירת זן הפניה וכיצד מאמץ ההפניה ישפיע על התוצאות. בפרוטוקול זה, V. פישרי זן ES114 ישמש זן התייחסות.</li>
	<li>
קביעת הבחירה ושיטות ההקרנה ישמ?...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

שיטת הדגירה שתוארה לעיל מספקת שיטה רבת-עוצמה לגילוי תחרות בין-חיידקית. גישה זו אפשרה לזיהוי של התחרות התוך ספציפי בין V. פישרי מבודד ואפיון של מנגנון תחרותי19. למרות השיטה שתוארה היה אופטימיזציה עבור החיידק הימי V. פישרי, זה יכול להיות שונה בקלות כדי להכיל מינים חיידקי?...

כתב יד זה מתאר שיטה מבוססת-תרבות כדי לקבוע אם שני מבודד חיידקי מסוגלים לאינטראקציות תחרותיות. כאשר לומדים אוכלוסיות מעורבות, חשוב להעריך את המידה שבה החיידק מבודד את האינטראקציה, במיוחד אם מבודד מתחרים ישירות באמצעות מנגנוני הפרעה. תחרות ההפרעות מתייחסת לאינטראקציות שבהן אוכלוסיה אחת מעכבת באופן ישיר את הצמיחה או הורגת אוכלוסיית מתחרה1. אינטראקציות אלה חשובות לזיהוי מכיוון שהן יכולות להיות בעלת השפעה מעמיקה על מבנה הקהילה ותפקודו של מיקרוביאלית2,3.
מנגנונים לתחרות מיקרוביאלית התגלו באופן נרחב בתוך גנום של חיידקים מסביבות מגוונות, כולל שני מארחים הקשורים וחיידקים חיים חופשיים4,5,6,7, 8,9. מגוון אסטרטגיות תחרות תוארו10,11 כולל מנגנונים המפזרים, כגון כימיקלים בקטרידקים1,12 ו מופרש פפטידים מיקרוביאלית13 , כמו גם מנגנונים תלויי-קשר המחייבים יצירת קשר עם תא תא להעברת מעכבות אפקטור לתאי יעד9,14,15,16,17 ,בן 18
למרות שcoincubations המבוסס על תרבות משתמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה5,8,19, כתב היד הזה מתאר כיצד להשתמש באפשרות לאפיין את מנגנון התחרות, כמו גם הצעות להתאמת הפרוטוקול לשימוש עם מינים חיידקיים אחרים. יתרה מזאת, שיטה זו מתארת גישות מרובות לניתוח ולהצגת הנתונים כדי לענות על שאלות שונות אודות אופי האינטראקציות התחרותיות. למרות הטכניקות המתוארות כאן היו בשימוש בעבר כדי לזהות את מנגנון ההרג הבינקטקטריאלי בבסיס התחרות הפנים מסוים בין זנים שיתופי של חיידקים vibrio פישרי מבודדים19, הם מתאימים מינים חיידקיים רבים, כולל מבודד סביבתי ופתוגנים אנושיים, ויכולים להיות מנוצלים להערכת מנגנונים תחרותיים תלויי-מגע ומפזרים. שלבים בפרוטוקול עשויים לדרוש אופטימיזציה של מינים חיידקיים אחרים. בהינתן כי מערכות מודל יותר מרחיבים את המחקרים שלהם מעבר לשימוש של אורגניזמים איזוגניים לכלול גנוטיפים שונים10,16,20,21, שיטה זו תהיה משאב חשוב לחוקרים המבקשים להבין כיצד התחרות משפיעה על מערכות מרובות זנים או רב מינים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

כתב יד זה מתאר את היסוד המבוסס על תרבות, הדגירה לגילוי ואפיון של אינטראקציות תחרותיות בין שתי אוכלוסיות בקטריאלי. שיטה זו מעסיקה פלמידים יציבים המאפשרים לכל אוכלוסיה להיות מתויג באופן מובהק עם יכולות עמידות לאנטיביוטיקה ברורים וחלבונים פלורסנט לבחירה ואפליה חזותית של כל אוכלוסיה, בהתאמה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ואת הדגירה של זנים vibrio פישרי מתחרה, הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית, וניתוח נתונים כמותיים. גישה זו פשוטה, התשואות תוצאות מהירות, וניתן להשתמש בה כדי לקבוע אם אוכלוסיה אחת הורגת או מעכבת את התפתחותם של אוכלוסיה אחרת, ואם התחרות מתווכת באמצעות מולקולה מפועלת או מחייבת מגע ישיר לתא הנייד. מכיוון שכל אוכלוסיית חיידקים מבטאת חלבון פלורסנט שונה, האבחנה מאפשרת אפליה מרחבית של אוכלוסיות מתחרות בתוך מושבה מעורבת. למרות השיטות המתוארות מתבצעות עם חיידק סימביוטי V. פישרי באמצעות התנאים אופטימיזציה עבור מין זה, הפרוטוקול יכול להיות מותאם לבודד בקטריאלי ביותר הניתנים לשימוש.

על מנת להעריך את האינטראקציות התחרותיות בין אוכלוסיות בקטריאליות, פרוטוקול שיטת הדגירה פותח וממוטב עבור V. פישרי. שיטה זו משתמשת פלמידים יציבים לקודד גנים עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלורסנט, המאפשר בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן. על-ידי ניתוח הנתונים שנ...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

הפרוטוקול שלנו מספק גישה פשוטה אך איתנה לזיהוי ואפיון מנגנונים תחרותיים בין זנים שונים של חיידקי Vibrio fischeri. שיטה זו משתמשת בפלסמידים יציבים המקודדים גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה וחלבונים פלואורסצנטיים המאפשרים בחירה דיפרנציאלית ואפליה חזותית של כל זן חיידקי בתרבות מעורבת. כדי להתחיל, להשתמש קיסם סטרילי כדי לגרד את התאים מצלחת אגר בגודל של גרגר אורז.תן שימוש חוזר בתאים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מרק LBS. כדי לשבור את גושי התאים, לחץ עליהם לצד הצינור ולאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה במרץ. סגור את הצינור והמערבולת למשך דקה עד שתי שניות וחזור על הפעולה אם גושי התאים עדיין גלויים עד שהדגימה אחידה מבחינה חזותית.חזור על שלבי הכנה אלה מגרד תאים למערבולת עבור כל הדגימות. למדוד ולתזמן את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר עבור כל הדגימות. כדי להשיג מדידת OD מדויקת, לדלל את הדגימות עד פי 10 באמצעות מרק LBS.לאחר מכן לנרמל כל מדגם OD 600 הרצוי. כדי לערבב את זן הייחוס ואת זן המתחרה ביחס של אחד לאחד, הוסף 100 מיקרוליטרים של כל זן מנורמל ל- OD 1.0 לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומערבולת למשך דקה עד שתי שניות. כפקד, מערבבים את זן הייחוס עם גרסה מתויגת באופן דיפרנציאלי של עצמו ומערבולת גם כן.זה קריטי כדי להשיג את יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול לשנות במידה ניכרת את התוצאה של הניסוי. כדי להבטיח הצלחה, צעד זה עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מין חיידקי נתון. לאחר חזרה על שלב זה עבור כל שכפול ביולוגי, צריכים להיות ארבעה שכפולים ביולוגיים עם זנים התייחסות מתויגים באופן דיפרנציאלי כמו פקדים וארבעה שכפולים ביולוגיים עם התייחסות מתויגת דיפרנציאלית וזנים מתחרים.כדי ליצור כתמי תרבות שישמשו למיקרוסקופיה פלואורסצנטית לאחר הדגירה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של כל פקד ותערובת ניסיונית על צלחת פטרי המכילה אגר LBS. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין על הספסל, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. כדי להפוך כתמי תרבות שישמש לכימות המושבה להרכיב יחידות עבור כל זן בסוף הניסוי, להוסיף 10 microliters של כל שליטה תערובות ניסיוני לתוך 24 צלחות גם המכיל מיליליטר אחד של אגר LBS לגם.לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, הדגירה את הצלחות ב 24 מעלות צלזיוס במשך חמש שעות. כדי לבצע דילול סדרתי של תערובות מטבע התחלתיות, סובב צלחת 96 בארות ב- 90 מעלות כך שיהיו שמונה עמודות ו- 12 שורות. סמן כל שורה בתווית עם מזהה המתח, מספר השכפול והשעה המתחילה באפס t.סמן את צלחות אגר LBS בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את סדרת דילול תוך הקפדה לזהות איזה זן כל צלחת אנטיביוטית בוחרת. עם פיפטה מרובת ערוצים, הוסיפו 180 מיקרוליטרים של מרק LBS לכל באר והשאירו את העמודה הראשונה ריקה לתערובת המטבעות הלא מזוהה. באמצעות פיפטה ערוץ יחיד 200 מיקרוליטר, להעביר 100 microliters של תערובת coincubation מן הצינור לתוך הטוב הראשון של העמודה הראשונה, ולאחר מכן להשליך את הקצה ולחזור על כל תערובות מטבע.עם פיפטה מרובת ערוצים, העבר 20 מיקרוליטרים מעמודה אחת לעמודה 2 ו- pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. השלך את העצות וחזור על כל עמודה תוך שמירה על עקביות עם מספר הצינורות למעלה ולמטה עבור כל דילול. עד הסוף, כל שורה תכיל דילול סדרתי של התערובת הראשונית פי 10.השתמש פיפטה רב ערוצי מצויד שמונה טיפים כדי לשאיף חמישה microliters מכל באר בסדרת דילול נקודה על צלחת אגר LBS בתוספת Kanamycin שבוחר עבור זן הייחוס. חזור על שלב זה כדי לבחור עבור המתח המתחרה איתור על צלחת משלימה Chloramphenicol. לאחר שהנקודות התייבשו לחלוטין, מניחים את הצלחות באינקובטור ב 24 מעלות צלזיוס.לאחר כתמי המטבע ו -24 צלחות באר כבר דגירה במשך חמש שעות ב 24 מעלות צלזיוס, להוסיף מיליליטר אחד של מרק LBS לכל באר. התן מחדש על-ידי צינור למעלה ולמטה עד שכל התאים יתווספו מחדש בהתאם למרץ שבו התאים יתווספו מחדש על-פני כל השכפולים. לאחר כל נקודה coincubation הוא resuspended, להכין צלחת 96 גם עבור דילול סדרתי צלחות אגר LBS עם אנטיביוטיקה המתאימה שבו לזהות את הדילול באותו אופן כמו שנעשה בעבר.כדי להשלים את הדילול הסדרתי עבור מדידות t סופיות ב 24 צלחות באר, לבצע שלבים המשמשים לדילול סדרתי של inoculum ההתחלה ולמקום כל דילול על צלחות אגר LBS כפי שנעשה בעבר. המשך בהדמיית כתמי המטבע על לוחות פטרי וניתוח נתונים כמתואר בכתב היד. בטיפול הניסיוני, זן הייחוס והמתחרה נמצאים בשיעור של 0.5 בתחילת הניסוי ובסוףו בהתאם לטיפול הבקרה.ערכי יומן RCI לא היו שונים סטטיסטית מאפס לטיפול הבקרה או כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד. נתונים אלה מצביעים על כך שלא הייתה תחרות בין זן הייחוס למתח המתחרה. לעומת זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, זן הייחוס ירד משיעור של 0.5 בהתחלה לחלק פחות מ 0.01 בסוף הניסוי.יתר על כן, ערכי RCI יומן היו גדולים משמעותית מאפס כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה 2. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ששיעור זן הייחוס ירד בנוכחות זן מתחרה שני המצביע על תחרות בין הזנים. כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן מתחרה אחד, CFUs של שני הזנים גדל במהלך חמש שעות ולא היו שונים באופן משמעותי רומז כי לא התרחשה תחרות.כמו כן, נצפתה התאוששות של כ-3200%, שלא הייתה שונה סטטיסטית מהבקרה. עם זאת, כאשר זן הייחוס היה דגירה עם זן המתחרה 2, CFUs זן התייחסות היו נמוכים באופן משמעותי מאשר זן שני CFUs בפקד בחמש שעות. כמו כן, כ-4% התאוששות נצפתה נמוכה משמעותית מהבקרה.בסך הכל, נתונים אלה מצביעים על כך שזן 2 החוצה התחרה זן הייחוס על ידי הריגת התאים שלה. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא השגת יחס ההתחלה הנכון כפי שהוא יכול להשפיע באופן משמעותי על התוצאות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

קולוניזציה של Euprymna scolopes קלמארי על ידי Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

נדידת תאים דנדריטים ניטור באמצעות<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H דימות תהודה מגנטית

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

פיתוח בינוני אגר chromogenic רגיש וספציפי יותר לצורך זיהוי של<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; ו אחר<em&gt; Vibrio</em&gt; מינים

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

טכניקות מעבדה המשמשות לשמירה על ביו-טיפוסים של<em&gt; ויבריו כולרה</em&gt; בידוד קליני ואיכותי

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

אינדוקציה של דיפרנציאציה נייד תא הדמיה אחת של<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; שחיין ותאי נחיל

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

לכימות ויבריו cholerae קולוניזציה ושלשולים במודל דג זברה למבוגרים

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...