Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Vi vil gjerne takke anmeldere for deres hjelpsomme tilbakemeldinger. A.N.S. ble støttet av Gordon og Betty Moore Foundation gjennom Grant GBMF 255,03 til Life Sciences Research Foundation.

1. Forbered stammer for Coincubation
<ol><li>Velg en passende referanse stamme som vil tjene som mål for bakteriell konkurranse under coincubation analysen. Se diskusjon for gode fremgangsmåter når du velger en referanse belastning og hvordan referanse belastningen vil påvirke resultatene. I denne protokollen, V. fischeri stamme ES114 vil tjene som referanse belastning.</li>
	<li>
Bestemme hvilke valg og screening metoder vil bli brukt til å skille mellom isolerer i coincubation</...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Den coincubation analysen beskrevet ovenfor gir en kraftig metode for å oppdage interbacterial konkurranse. Denne tilnærmingen er tillatt for identifisering av intraspesifikk konkurranse mellom V. fischeri isolerer og karakterisering av konkurranse mekanismen19. Selv om metoden beskrevet var optimalisert for den marine bakterien V. fischeri, kan det enkelt endres for å imøtekomme andre bakterielle arter, inkludert klinisk og miljømessige isolerer. Det er viktig å merke seg ...

Dette manuskriptet skisserer en kultur-basert metode for å avgjøre om to bakterielle isolerer er i stand til konkurransedyktige interaksjoner. Når man studerer blandede populasjoner, er det viktig å vurdere i hvilken grad bakteriell isolerer samhandle, spesielt om isolat er direkte konkurrerer gjennom forstyrrelser mekanismer. Interferens konkurransen refererer til interaksjoner der en befolkning direkte hemmer veksten eller dreper en konkurrent befolkning1. Disse interaksjoner er viktig å identifisere fordi de kan ha dyptgripende virkninger på en mikrobiell samfunnets struktur og funksjon2,3.
Mekanismer for mikrobiell konkurranse har blitt oppdaget grovt i genomer av bakterier fra ulike miljøer, inkludert både vert-assosiert og fri-levende bakterier4,5,6,7, 8,9. En rekke konkurranse strategier har blitt beskrevet10,11 , inkludert ekstremt mekanismer, slik som bakteriedrepende kjemikalier1,12 og skilles ut antimikrobielle peptider13 , i tillegg til kontakt avhengige mekanismer som krever celle kontakt for å overføre en hemmende effektor til målcellene9,14,15,16,17 ,18.
Selv om kultur-baserte coincubations brukes ofte i mikrobiologi5,8,19, dette manuskriptet skisserer hvordan du bruker analysen til å karakterisere mekanismen av konkurransen, samt forslag for å tilpasse protokollen for bruk med andre bakteriearter. Videre beskriver denne metoden flere tilnærminger for å analysere og presentere data for å svare på ulike spørsmål om arten av konkurrerende interaksjoner. Selv om teknikkene som beskrives her ble brukt tidligere til å identifisere interbacterial drap mekanismen underliggende intraspesifikk konkurranse mellom symbiotisk stammer av coisolated Vibrio fischeri bakterier19, de er egnet for mange bakterielle arter, inkludert miljømessige isolerer og menneskelige patogener, og kan utnyttes til å evaluere både kontakt-avhengige og ekstremt konkurransedyktige mekanismer. Trinn i protokollen kan kreve optimalisering for andre bakterielle arter. Gitt at flere modellsystemer utvider sine studier utover bruk av isogenic organismer å inkludere ulike genotyper10,16,20,21, vil denne metoden være en verdifull ressurs for forskere som søker å forstå hvordan konkurransen påvirker multi-stamme eller multi-arter systemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Dette manuskriptet beskriver en kultur BAS ert, coincubation analyse for å påvise og karakteriserer konkurrerende interaksjoner mellom to bakterie populasjoner. Denne metoden sysselsetter stabile plasmider som gjør at hver populasjon skal differensielt merket med distinkte antibiotikaresistens evner og fluorescerende proteiner for valg og visuell diskriminering av hver populasjon, henholdsvis. Her beskriver vi utarbeidelse og coincubation av konkurrerende Vibrio fischeri stammer, fluorescens mikroskopi Imaging, og kvantitativ dataanalyse. Denne tilnærmingen er enkel, gir raske resultater, og kan brukes til å avgjøre om en befolkning dreper eller hemmer veksten av en annen befolkning, og om konkurransen er formidlet gjennom et ekstremt molekyl eller krever direkte celle-celle kontakt. Fordi hver bakterie befolkning uttrykker et annet fluorescerende protein, tillater analysen den romlige diskriminering av konkurrerende populasjoner i en blandet koloni. Selv om de beskrevne metodene utføres med symbiotisk bakterien V. fischeri ved hjelp av betingelser som er optimalisert for denne arten, kan protokollen tilpasses for de fleste culturable bakteriell isolat.

For å kunne vurdere konkurrerende interaksjoner mellom bakterie populasjoner, ble en coincubation analyse protokoll utviklet og optimalisert for V. fischeri. Denne metoden utnytter stabile plasmider som koder antibiotikaresistens gener og fluorescerende proteiner, noe som åpner for differensial valg og visuell diskriminering av hver stamme. Ved å analysere data samlet inn fra coincubation analysen, kan den konkurransedyktige utfallet av en interaksjon og mekanismen av samspill...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bakterier kode ulike mekanismer for å engasjere seg i interbacterial konkurranse. Her presenterer vi en kultur-basert protokoll for karakteriserer konkurransedyktige interaksjoner mellom bakteriell isolerer og hvordan de påvirker den romlige strukturen i en blandet befolkning.

Coincubation analysen for kvantifisere konkurrerende interaksjoner mellom Vibrio fischeri isolerer

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Vår protokoll gir en enkel, men robust tilnærming til å identifisere og karakterisere konkurransedyktige mekanismer mellom ulike stammer av Vibrio fischeri bakterier. Denne metoden bruker stabile plasmider som koder ulike antibiotikaresistensgener og fluorescerende proteiner som tillater differensialvalg og visuell diskriminering av hver bakteriell stamme i en blandet kultur. Til å begynne med, bruk en steril tannpirker til å skrape cellene fra agarplaten på størrelse med et riskorn.Resuspend cellene i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør som inneholder en milliliter LBS kjøttkraft. For å bryte opp celleklumper, trykk dem inn i siden av røret og pipette opp og ned kraftig. Lukk røret og virvelen i ett til to sekunder, og gjenta om celleklumpene fortsatt er synlige til prøven er visuelt ensartet.Gjenta disse forberedelsestrinnene fra celleskrap til vortexing for alle prøver. Mål og registrer den optiske tettheten ved 600 nanometer for alle prøver. For å oppnå en nøyaktig OD-måling, fortynne prøvene opptil 10 ganger ved hjelp av LBS kjøttkraft.Normaliser deretter hver prøve til ønsket OD 600. For å blande referansestammen og konkurrentbelastningen i et ett til ett-forhold, tilsett 100 mikroliter av hver stamme normalisert til OD 1,0 til et merket 1,5 milliliter sentrifugerør og virvel i ett til to sekunder. Som en kontroll, bland referansestammen med en differensialmerket versjon av seg selv og vortex også.Det er avgjørende å oppnå riktig startforhold, da det kan endre utfallet av eksperimentet betydelig. For å sikre suksess, kan dette trinnet kreve optimalisering for en gitt bakteriell art. Etter å ha gjentatt dette trinnet for hver biologiske replikering, bør det være fire biologiske repliker med differensialt kodede referansestammer som kontroller og fire biologiske replikeringer med differensialt merket referanse og konkurrentstammer.For å lage kulturflekker som skal brukes til fluorescensmikroskopi etter inkubasjonen, tilsett 10 mikroliter av hver kontroll og eksperimentell blanding på en Petri-plate som inneholder LBS agar. Etter at flekkene har tørket helt på benken, inkuber platene ved 24 grader Celsius i 24 timer. For å lage kulturflekker som vil bli brukt til å kvantifisere koloniformingsenhetene for hver stamme på slutten av eksperimentet, legg til 10 mikroliter av hver kontroll og eksperimentelle blandinger i 24 brønnplater som inneholder en milliliter LBS agar per brønn.Etter at flekkene er helt tørket, inkuber platene ved 24 grader Celsius i fem timer. For å utføre en seriell fortynning av startmyntcubation blandinger, rotere en 96 brønnplate 90 grader slik at det er åtte kolonner og 12 rader. Merk hver rad med belastnings-ID-en, replikernummeret og tiden som starter med t zero.Merk LBS agarplater supplert med riktig antibiotika for å oppdage fortynningsserien samtidig som du sørger for å identifisere hvilken belastning hver antibiotikaplate velger for. Med en flerkanals pipette legger du til 180 mikroliter LBS-kjøttkraft i hver brønn, slik at den første kolonnen er tom for den ufortynnede myntkubasjonsblandingen. Bruk en 200 mikroliters enkanals pipette, overfør 100 mikroliter av myntcubasjonsblandingen fra røret til den første brønnen i den første kolonnen, kast deretter spissen og gjenta for alle sammenleggsblandinger.Med en flerkanals pipette overfører du 20 mikroliter fra kolonne én til kolonne to og pipetten opp og ned for å blande. Kast spissene og gjenta for hver kolonne samtidig som den er i samsvar med antall pipettering opp og ned for hver fortynning. Ved slutten vil hver rad inneholde en 10-ganger seriell fortynning av den første blandingen.Bruk en flerkanals pipette utstyrt med åtte tips for å aspirere fem mikroliter fra hver brønn i en fortynningsserie og se på Kanamycin-supplert LBS agarplate som velger referansestammen. Gjenta dette trinnet for å velge for konkurrenten belastning spotting på kloramfenikol supplert plate. Etter at flekkene har tørket helt, legg platene i inkubatoren ved 24 grader Celsius.Etter at sammenfallende flekker og 24 brønnplater har blitt inkubert i fem timer ved 24 grader Celsius, legg til en milliliter LBS kjøttkraft til hver brønn. Resuspend ved å pipettere opp og ned til alle celler har blitt resuspended å være i samsvar med kraften der cellene er resuspended på tvers av alle repliker. Når hvert sammenfallende sted er resuspended, forberede en 96 brønnplate for en seriell fortynning og LBS agar plater med passende antibiotika for å oppdage fortynning på samme måte som tidligere gjort.For å fullføre seriefortynningen for t endelige målinger i de 24 brønnplatene, utfør trinn som brukes til seriell fortynning av startinokulumet og plasser hver fortynning på LBS agarplater som gjort tidligere. Fortsett med å forestille seg myntcubation flekker på Petri plater og dataanalyse som beskrevet i manuskriptet. I eksperimentell behandling er referansestammen og konkurrentstammen man til stede i en andel på 0,5 i begynnelsen og slutten av eksperimentet som er i samsvar med kontrollbehandlingen.Log RCI-verdier var ikke statistisk forskjellig fra null for kontrollbehandlingen eller når referansestammen ble inkubert med konkurrentstamme en. Disse dataene tyder på at det ikke var noen konkurranse mellom referansebelastningen og konkurrenten belastning en. Derimot, når referansestammen ble inkubert med konkurrentstamme to, reduserte referansestammen fra en andel på 0,5 i begynnelsen til en andel mindre enn 0,01 på slutten av eksperimentet.Videre var log RCI-verdier betydelig større enn null når referansestammen ble inkubert med konkurrentstamme to. Sammen indikerer disse dataene at andelen av referansestammen redusert i nærvær av konkurrentstamme to som tyder på konkurranse mellom stammene. Når referansestammen ble inkubert med konkurrentstamme, økte CfUer av begge stammene i løpet av fem timer og var ikke vesentlig annerledes, noe som tyder på at ingen konkurranse skjedde.Det ble også observert ca. 3200 % gjenoppretting som ikke var statistisk forskjellig fra kontrollen. Men når referansestammen ble inkubert med konkurrentstamme to, var referansebelastningen CfUer betydelig lavere enn belastningen to CfUer i kontrollen på fem timer. Også omtrent 4% gjenoppretting ble observert betydelig lavere enn kontrollen.Til sammen indikerer disse dataene at belastning to ut konkurrerte referansestammen ved å drepe cellene. Det viktigste trinnet i denne prosedyren er å oppnå riktig startforhold, da det kan påvirke resultatene betydelig.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Kolonisering av Euprymna scolopes Squid av Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Utvikling av en mer sensitiv og spesifikk kromogen Agar Medium for deteksjon av<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Og annet<em&gt; Vibrio</em&gt; Arter

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratorieteknikker brukes til å opprettholde og skille biotyper av<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Kliniske og miljømessige isolater

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induksjon av Cellulær Differensiering og Single Cell Imaging of<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Svømmer- og svovelceller

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infeksjon av menneskelig lymfoid vev og Female Genital Mucosa humant immunsviktvirus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Kvantifisere Vibrio cholerae kolonisering og diaré i voksen sebrafisk modell

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...