Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их полезную обратную связь. A.N.S. была поддержана Фондом Гордона и Бетти Мур через Грант GBMF 255.03 в Фонд исследований в области наук о жизни.

1. Подготовка штаммов для Coincubation
<ol><li>Выберите соответствующий эталонный штамм, который будет служить мишенью для бактериальной конкуренции во время проверки coincubation. Ознакомьтесь с рекомендациями при выборе эталонного штамма и как эталонный штамм повлияет на результаты. В э?...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Анализ монетокубации, описанный выше, представляет собой мощный метод обнаружения межбактериальной конкуренции. Такой подход позволил выявить внутривидовую конкуренцию среди изолятов V. fischeri и характеристику конкурентного механизма19. Хотя описанный метод был оптим...

В этой рукописи излагается культурный метод определения того, способны ли два бактериальных изолята к конкурентным взаимодействиям. При изучении смешанных популяций важно оценить, в какой степени бактериальные изоляты взаимодействуют, особенно в том, что изоляты непосредственно конкурируют с помощью механизмов помех. Интерференция конкуренции относится к взаимодействиям, где одна популяция непосредственно препятствует росту или убивает конкурента населения1. Эти взаимодействия имеют важное значение для выявления, поскольку они могут иметь глубокое воздействие на структуру микробного сообщества и функции2,3.
Механизмы микробной конкуренции были широко обнаружены в геномах бактерий из различных сред, включая как хос-ассоциированных и свободно живущих бактерий4,5,6,7, 8,9. Различные стратегии конкуренции были описаны10,11 в том числе диффузивные механизмы, такие как бактерицидные химические вещества1,12 и секретированные антимикробные пептиды13 , а также контактно-зависимые механизмы, которые требуют контакта клетокдля передачи ингибирующего эффектора в клетки-мишени 9,14,15,16,17 ,18.
Хотя культурные монеты обычно используются вмикробиологии 5,8,19, эта рукопись описывает, как использовать анализ для характеристики механизма конкуренции, а также предложения по адаптации протокол для использования с другими бактериальными видами. Кроме того, этот метод описывает несколько подходов к анализу и представлению данных для ответа на различные вопросы о характере конкурентных взаимодействий. Хотя методы, описанные здесь были использованы ранее для выявления межбактериального механизма убийства, лежащего в основе внутриспецифической конкуренции между симбиотических штаммов coisolated Vibrio fischeri бактерий19, они подходят для многие бактериальные виды, включая экологические изоляты и патогены человека, и могут быть использованы для оценки как контакт-зависимых, так и диффузионных конкурентных механизмов. Шаги в протоколе могут потребовать оптимизации для других видов бактерий. Учитывая, что все больше модельных систем расширяют свои исследования за пределы использования изогенных организмов, чтобы включить различные генотипы10,16,20,21, этот метод будет ценным ресурсом для исследователей, стремящихся понять, как конкуренция влияет на многослойные или многовидовые системы.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Данная рукопись описывает культурный, монетный опрос для обнаружения и характеристики конкурентных взаимодействий между двумя бактериальными популяциями. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые позволяют каждой популяции быть дифференимно помечены с различными возможностями устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки для отбора и визуальной дискриминации каждой популяции, соответственно. Здесь мы описываем подготовку и coincubation конкурирующих штаммов Vibrio fischeri, флуоресцентную микроскопию изображений и количественный анализ данных. Этот подход прост, дает быстрые результаты, и может быть использован для определения того, одна популяция убивает или подавляет рост другой популяции, и является ли конкуренция опосредована через диффузионную молекулу или требует прямого контакта клеток. Поскольку каждая бактериальная популяция выражает различные флуоресцентные белки, анализ позволяет пространственной дискриминации конкурирующих групп населения в смешанной колонии. Хотя описанные методы выполняются с помощью симбиотической бактерии V. fischeri с использованием условий, оптимизированных для этого вида, протокол может быть адаптирован для большинства виновных бактериальных изолятов.

Для оценки конкурентного взаимодействия между бактериальными популяциями был разработан и оптимизирован протокол проверки монеток для V. fischeri. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые кодируют гены устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки, ...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Бактерии кодируют различные механизмы для участия в межбактериальной конкуренции. Здесь мы представляем культурный протокол для характеристики конкурентных взаимодействий между бактериальными изолятами и того, как они влияют на пространственную структуру смешанной популяции.

Coincubation Асссе для количественной оценки конкурентных взаимодействий между Vibrio fischeri Изоляты

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Наш протокол обеспечивает простой, но надежный подход к выявлению и характеристике конкурентных механизмов между различными штаммами бактерий Vibrio fischeri. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые кодируют различные гены устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки, которые позволяют дифференциальный отбор и визуальную дискриминацию каждого бактериального штамма в смешанной культуре. Для начала используйте стерильную зубочистку, чтобы соскребать клетки с агарной пластины размером с рисовое зерно.Повторное содержание клеток в 1,5 миллилитровой микроцентрифуге, содержащей один миллилитр бульона LBS. Чтобы разбить клеточные сгустки, нажмите их в сторону трубки, а затем пипетки вверх и вниз энергично. Закройте трубку и вихрь на одну-две секунды и повторите, если скопления клеток все еще видны до тех пор, пока образец визуально не будет однородным.Повторите эти шаги подготовки от соскабливания клеток до вихрей для всех образцов. Измерьте и замитьте оптическую плотность на 600 нанометров для всех образцов. Чтобы получить точное измерение OD, разбавить образцы до 10 раз с помощью бульона LBS.Затем нормализует каждый образец до желаемого OD 600. Чтобы смешать эталонный штамм и штамм конкурента в соотношении один к одному, добавьте 100 микролитров каждого штамма, нормализованных до OD 1.0, к помеченной 1,5 миллилитрированной центрифуге трубки и вихря в течение одной-двух секунд. В качестве контроля смешайте эталонный штамм с дифференциально помеченной версией себя и вихря.Очень важно достичь правильного исходного соотношения, поскольку оно может значительно изменить результат эксперимента. Чтобы обеспечить успех, этот шаг может потребовать оптимизации для данного бактериального вида. После повторения этого шага для каждого биологического репликации, должно быть четыре биологических репликаций с дифференциально помечены эталонные штаммы в качестве элементов управления и четыре биологических репликаций с дифференциально помечены ссылки и конкурента штаммов.Чтобы сделать культурные пятна, которые будут использоваться для флуоресценции микроскопии после инкубации, добавить 10 микролитров каждого управления и экспериментальной смеси на пластину Петри, содержащую LBS агар. После того, как пятна полностью высохли на скамейке, инкубировать пластины при 24 градусах по Цельсию в течение 24 часов. Чтобы сделать культурные пятна, которые будут использоваться для количественной оценки единиц формирования колонии для каждого штамма в конце эксперимента, добавьте 10 микролитров каждого управления и экспериментальных смесей в 24 пластины, содержащие один миллилитр LBS агара на колодец.После того, как пятна полностью высохли, инкубировать пластины при 24 градусах по Цельсию в течение пяти часов. Для выполнения последовательного разбавления стартовых смесей coincubation, поверните 96 хорошо пластины 90 градусов, так что есть восемь столбцов и 12 строк. Наклейте этикетку на каждую строку с идентификатором деформации, номером репликации и временем, начинающимся с t zero.Этикетка LBS агар пластины дополнены соответствующим антибиотиком, на котором обнаружить серию разбавления, убедившись, чтобы определить, какой штамм каждой пластины антибиотиков выбирает для. С многоканарной пипеткой добавьте 180 микролитров бульона LBS к каждому колодец, оставляя первую колонку пустой для неразбавленной смеси coincubation. Используя 200 микролитера одноканарной пипетки, перенесите 100 микролитров смеси чеканки из трубки в первую колодец первой колонки, затем отбросьте наконечник и повторите для всех смесей coincubation.С многоканарной пипеткой, передача 20 микролитров от столбца один к столбу два и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать. Откажитесь от наконечников и повторите для каждой колонки, в то время как в соответствии с числом трубопроводов вверх и вниз для каждого разбавления. В конце концов, каждый ряд будет содержать 10-кратное серийное разбавление начальной смеси.Используйте многоканарновые пипетки оснащены восемью советами, чтобы аспирировать пять микролитров из каждой хорошо в серии разбавления и пятно на Kanamycin дополнен LBS агар пластины, которая выбирает для эталонного штамма. Повторите этот шаг, чтобы выбрать для конкурента штамма пятнистость на Chloramphenicol дополненной пластины. После того, как пятна полностью высохли, поместите пластины в инкубатор при 24 градусах по Цельсию.После coincubation пятна и 24 хорошо пластины были инкубированы в течение пяти часов при 24 градусов по Цельсию, добавить один миллилитр бульона LBS к каждому хорошо. Resuspend путем pipetting вверх и вниз до тех пор пока все клетки не будут resuspended в соответствии с силой в которой клетки resuspended через все репликации. После того, как каждое место coincubation повторно, подготовить 96 хорошо пластины для серийного разбавления и LBS агар пластин с соответствующими антибиотиками, на которых обнаружить разбавления таким же образом, как это было сделано ранее.Для завершения серийного разбавления для т окончательных измерений в 24 пластины хорошо, выполнить шаги, используемые для последовательного разбавления стартового инокулума и месте каждого разбавления на пластинах LBS агара, как это было сделано ранее. Продолжить визуализацию пятен монет на пластинах Петри и анализ данных, описанных в рукописи. В экспериментальном лечении эталонный штамм и штамм конкурента один присутствуют в пропорции 0,5 в начале и конце эксперимента в соответствии с контрольной обработкой.Значения RCI журнала статистически не отличались от нулевых для контрольного лечения или когда эталонный штамм инкубировался штаммом конкурента. Эти данные свидетельствуют о том, что не было никакой конкуренции между эталонной деформацией и штаммом конкурента. В отличие от этого, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два, эталонный штамм снизился с доли 0,5 в начале до доли менее 0,01 в конце эксперимента.Кроме того, значения RCI журнала были значительно больше нуля, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что доля эталонного штамма снизилась в присутствии конкурента штамма два предлагая конкуренцию между штаммами. Когда эталонный штамм был инкубирован с конкурентом штамм один, CFUs обоих штаммов увеличилось в течение пяти часов и не были существенно отличаются, предполагая, что никакой конкуренции не произошло.Кроме того, было отмечено примерно 3200%восстановление, которое статистически не отличалось от контроля. Однако, когда эталонный штамм был инкубирован с штаммом конкурента два, эталонный штамм CFUs были значительно ниже, чем напряжение двух CFUs в контроле на пять часов. Кроме того, примерно 4%восстановление наблюдалось значительно ниже, чем контроль.В общей сложности эти данные свидетельствуют о том, что штамм два из конкурировали эталонного штамма, убивая его клетки. Наиболее важным шагом в этой процедуре является достижение правильного исходного соотношения, поскольку оно может существенно повлиять на результаты.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Колонизация Euprymna scolopes Squid по Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Магнитно-резонансная томография

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Развитие более чувствительным и специфичным хромогенного агаровой среде для обнаружения<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; И другие<em&gt; Vibrio</em&gt; Виды

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Клинические и экологические изоляты

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Плоттеры и богомольцы

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...