Name: coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Vi vill tacka recensenter för deras hjälpsamma feedback. A.N.S. stöddes av Gordon och Betty Moore Foundation genom Grant GBMF 255,03 till Life Sciences Research Foundation.

1. Förbered stammar för Koinkubation
<ol><li>Välj en lämplig referensstam som kommer att fungera som mål för bakterie konkurrens under koinkubations analysen. Se diskussion för bästa praxis när du väljer en referensstam och hur referens stammen kommer att påverka resultaten. I detta protokoll kommer V. fischeri Strain ES114 att fungera som referensstam.</li>
	<li>
Fastställa vilka urvals-och screeningmetoder som ska användas för att skilja mellan isolat i koinkubations-</...

<ol>
	<li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+winnowing:+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis.">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li><li>D&#246;rr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination.">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li><li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties.">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li><li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria,+and+is+differentially+regulated+from+system+2.">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086 (2013).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut.">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).</li><li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export.">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Garc&#237;a-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated,+glycine+zipper+proteins.">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869 (2017).</li><li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition.">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li><li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war.">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li><li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+microbial+interspecies+signaling.">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li><li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo.">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li><li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage.">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li><li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+CDI+systems+multicolored,+facultative,+helping+greenbeards?.">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?.</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li><li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+growth+inhibition+(CDI)+and+CdiB/CdiA+two-partner+secretion+proteins.">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li><li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim,+load,+fire:+the+type+VI+secretion+system,+a+bacterial+nanoweapon.">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li><li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rules+of+engagement:+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li><li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host.">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li><li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions.">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae.">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li><li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ.">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li><li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells.">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li><li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae.">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).</li><li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734 (2009).</li><li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains.">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li><li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY.">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li><li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae.">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li><li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer.">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li><li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift:+CpsV+regulates+type+VI+secretion,+biofilm+formation,+and+association+with+zooplankton.">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis.">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).</li></ol>

Den coinkubations analys som beskrivs ovan ger en kraftfull metod för att upptäcka interbakteriell konkurrens. Detta tillvägagångssätt möjliggjorde identifiering av intraspecifika konkurrens mellan V. fischeri isolat och karaktärisering av konkurrensmekanismen19. Även om den beskrivna metoden var optimerad för marin bakterien V. fischeri, kan den lätt modifieras för att rymma andra bakteriearter, inklusive kliniska och miljöisolerade isolat. Det är viktigt att notera...

Detta manuskript beskriver en kulturbaserad metod för att avgöra om två bakteriella isolat klarar av konkurrerande interaktioner. Vid studier av blandade populationer är det viktigt att bedöma i vilken utsträckning de bakteriella isolaterna interagerar, särskilt om isolat konkurrerar direkt genom interferensmekanismer. Störning konkurrens hänvisar till interaktioner där en population direkt hämmar tillväxten eller dödar en konkurrent befolkning1. Dessa interaktioner är viktiga att identifiera eftersom de kan ha djupgående effekter på en mikrobiell gemenskap struktur och funktion2,3.
Mekanismer för mikrobiell konkurrens har i stort sett upptäckts i genomet av bakterier från olika miljöer, inklusive både värdassocierade och fritt levande bakterier4,5,6,7, 8,9. En rad olika konkurrensstrategier har beskrivits10,11 inklusive diffusbara mekanismer, såsom bakteriedödande kemikalier1,12 och utsöndras antimikrobiella peptider13 , samt kontaktberoende mekanismer som kräver cell-cell kontakt för att överföra en hämmande effekt till målceller9,14,15,16,17 ,18.
Även om kulturbaserade coincubations används ofta i mikrobiologi5,8,19, beskriver detta manuskript hur man använder analysen för att karakterisera mekanismen för konkurrens, samt förslag för att anpassa protokollet för användning med andra bakteriearter. Dessutom beskriver denna metod flera metoder för att analysera och presentera data för att besvara olika frågor om arten av de konkurrensmässiga interaktioner. Även om de tekniker som beskrivs här användes tidigare för att identifiera den interbakteriella mördande mekanismen bakom intraspecifika konkurrens mellan symbiotiska stammar av isolerade Vibrio fischeri bakterier19, de är lämpliga för många bakteriearter, inklusive miljöisolat och humana patogener, och kan utnyttjas för att utvärdera både kontakt-beroende och diffus konkurrenskraftiga mekanismer. Stegen i protokollet kan kräva optimering för andra bakteriearter. Med tanke på att fler modellsystem utökar sina studier utöver användningen av isogena organismer för att inkludera olika genotyper10,16,20,21, kommer denna metod att vara en värdefull resurs för forskare som vill förstå hur konkurrensen påverkar system med flera stammar eller flera arter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L single channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-84</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-900</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calculator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 &#956;g /mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td>stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 &#956;g/mL LBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SA1J788H5</td>
			<td>0.22 &#956;m nitrocellulose membrane (pk of 100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 0.1-10 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 200 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-500</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TipOne 1000 &#956;L starter system</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2520</td>
			<td>10 racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBS media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris Buffer (pH ~7.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Technical</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>DF0812-17-9</td>
			<td>15 g (Add only for plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>950 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S640-3</td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP97265</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9727-2</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coincubation assay for quantifying competitive interactions between vibrio fischeri isolates

Detta manuskript beskriver en kulturbaserad, koinkubations analys för att upptäcka och karakterisera konkurrerande interaktioner mellan två bakterie populationer. Denna metod sysselsätter stabila plasmider som gör att varje population differentially märkta med distinkta antibiotikaresistens kapacitet och fluorescerande proteiner för urval och visuell diskriminering av varje population, respektive. Här beskriver vi förberedelserna och coinkubationen av konkurrerande Vibrio fischeri -stammar, fluorescensmikroskopi-avbildning och kvantitativ dataanalys. Denna metod är enkel, ger snabba resultat, och kan användas för att avgöra om en population dödar eller hämmar tillväxten av en annan population, och om konkurrensen förmedlas genom en diffus molekyl eller kräver direkt cell-cell kontakt. Eftersom varje bakterie population uttrycker ett annat fluorescerande protein, medger analysen rumslig diskriminering av konkurrerande populationer inom en blandad koloni. Även om de beskrivna metoderna utförs med symbiotiska bakterien V. fischeri med hjälp av villkor som optimerats för denna art, kan protokollet anpassas för de flesta odlingsbara bakteriella isolat.

För att kunna bedöma de konkurrensmässiga interaktionerna mellan bakterie populationer utvecklades och optimerades en koinkuberingstest för V. fischeri. Denna metod använder stabila plasmider som kodar antibiotikaresistens gener och fluorescerande proteiner, möjliggör differentiell urval och visuell diskriminering av varje stam. Genom att analysera data som samlats in från koinkubations analysen kan det konkurrensmässiga utfallet av en interaktion och Interaktionsmekanis...

Watch this Scientific Journal Video about Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates at JoVE.com

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bakterier kodar för olika mekanismer för att bedriva interbakteriell konkurrens. Här presenterar vi ett kulturbaserat protokoll för att karakterisera konkurrensmässiga interaktioner mellan bakteriella isolat och hur de påverkar den rumsliga strukturen hos en blandad population.

Koinkubations-analys för kvantifiering av konkurrerande interaktioner mellan Vibrio fischeri -isolat

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Vårt protokoll ger en enkel men robust metod för att identifiera och karakterisera konkurrensmekanismer mellan olika stammar av Vibrio fischeri bakterier. Denna metod använder stabila plasmider som kodar olika antibiotikaresistens gener och fluorescerande proteiner som möjliggör differentiell urval och visuell diskriminering av varje bakteriestam i en blandad kultur. Till att börja med, använd en steril tandpetare för att skrapa cellerna från agarplattan i storleken av ett riskorn.Resuspend cellerna i en 1,5 milliliter microcentrifug rör som innehåller en milliliter lbs buljong. För att bryta upp cellklumparna trycker du in dem i sidan av röret och sedan pipetteras upp och ner kraftigt. Stäng röret och virveln i en till två sekunder och upprepa om cellklumparna fortfarande är synliga tills provet är visuellt enhetligt.Upprepa dessa förberedelsesteg från cellskrapning till vortexing för alla prover. Mät och antele den optiska densiteten vid 600 nanometer för alla prover. För att erhålla en exakt OD-mätning, späd proverna upp till 10-faldig med lbs-buljong.Normalisera sedan varje prov till önskad OD 600. För att blanda referensstammen och konkurrentstammen i ett ett till ett förhållande, tillsätt 100 mikroliter av varje stam normaliserad till OD 1.0 till ett märkt centrifugeringsrör och virvel på 1,5 milliliter i en till två sekunder. Som en kontroll, blanda referensstammen med en differentially taggad version av sig själv och virvel också.Det är viktigt att uppnå rätt startförhållande eftersom det avsevärt kan ändra resultatet av experimentet. För att säkerställa framgång, kan detta steg kräva optimering för en viss bakterieart. Efter att ha upprepat detta steg för varje biologisk replikat, bör det finnas fyra biologiska replikat med differentiellt taggade referensstammar som kontroller och fyra biologiska replikat med differentially taggade referens- och konkurrentstammar.För att göra kulturfläckar som kommer att användas för fluorescensmikroskopi efter inkubationen, tillsätt 10 mikroliter av varje kontroll och experimentell blandning på en Petri-platta som innehåller LBS-agar. Efter fläckarna har helt torkat på bänken, ruva plattorna vid 24 grader Celsius i 24 timmar. För att göra kulturfläckar som kommer att användas för att kvantifiera kolonin bildar enheter för varje stam i slutet av experimentet, tillsätt 10 mikroliter av varje kontroll och experimentella blandningar i 24 brunnsplattor som innehåller en milliliter LBS agar per brunn.Efter fläckarna har helt torkat, ruva plattorna vid 24 grader Celsius i fem timmar. För att utföra en serieutspädning av start coincubation blandningar, rotera en 96 väl platta 90 grader så det finns åtta kolumner och 12 rader. Märk varje rad med stam-ID, replikatnummer och tiden som börjar med t noll.Etikett LBS agar plattor kompletteras med lämplig antibiotika som att upptäcka utspädning serien samtidigt se till att identifiera vilken stam varje antibiotikaplatta väljer för. Med en flerkanalspipett, tillsätt 180 mikroliter lbs-buljong till varje brunn som lämnar den första kolumnen tom för den outspädda coincubationsblandningen. Med hjälp av en 200 mikroliter enkanalspipett, överför 100 mikroliter av coincubationsblandningen från röret till den första brunnen i den första kolumnen, kassera sedan spetsen och upprepa för alla coincubationsblandningar.Med en flerkanalspipett överför du 20 mikroliter från kolumn ett till kolumn två och pipetter upp och ner för att blanda. Kassera spetsarna och upprepa för varje kolumn samtidigt som det överensstämmer med antalet pipettering upp och ner för varje utspädning. I slutet kommer varje rad att innehålla en 10-faldig serieutspädning av den ursprungliga blandningen.Använd en flerkanalspipett försedd med åtta spetsar för att aspirera fem mikroliter från varje brunn i en utspädningsserie och avse på kanamycintillräckt LBS-agarplattan som väljer för referensstammen. Upprepa detta steg för att välja för konkurrenten stammen spotting på Chloramphenicol kompletterad platta. Efter fläckarna har torkat helt, placera plattorna i inkubatorn vid 24 grader Celsius.Efter coincubation fläckar och 24 brunnsplattor har inkuberas i fem timmar vid 24 grader Celsius, tillsätt en milliliter LBS buljong till varje brunn. Resuspend genom pipettering upp och ner tills alla celler har återsuspended är förenligt med den kraft där cellerna är resuspended över alla replikat. När varje coincubation plats är återanvänds, förbereda en 96 väl platta för en serieutspädning och LBS agar plattor med lämpliga antibiotika som att upptäcka utspädning på samma sätt som tidigare gjorts.För att slutföra den seriella utspädningen för t slutliga mätningar i de 24 brunnsplattorna, utför steg som används för den seriella utspädningen av startinokulat och avspädning varje spädning på LBS-agarplattor som tidigare gjorts. Fortsätt med att avbilda coincubationsfläckarna på Petri-plattorna och dataanalysen enligt beskrivningen i manuskriptet. I den experimentella behandlingen, referensstammen och konkurrentstam en är närvarande vid en andel av 0,5 i början och slutet av experimentet överensstämmer med kontrollbehandlingen.Log RCI-värden var inte statistiskt annorlunda än noll för kontrollbehandlingen eller när referensstammen inkuberades med konkurrentstam en. Dessa uppgifter tyder på att det inte fanns någon konkurrens mellan referensstammen och konkurrentstammen en. När referensstammen inkuberades med konkurrentstam två minskade referensstammen däremot från en andel på 0,5 i början till en andel som var mindre än 0,01 i slutet av försöket.Vidare var log RCI-värden betydligt större än noll när referensstammen inkuberades med konkurrentstam två. Tillsammans tyder dessa uppgifter på att andelen av referensstammen minskade i närvaro av konkurrentstam två som tyder på konkurrens mellan stammarna. När referensstammen inkuberades med konkurrentstam en, ökade CFUs av båda stammarna under loppet av fem timmar och var inte signifikant annorlunda vilket tyder på att ingen konkurrens inträffade.Dessutom observerades cirka 3200%återhämtning som inte var statistiskt annorlunda än kontrollen. När referensstammen inkuberades med konkurrentstam två var referensstam CFUs dock betydligt lägre än stam två CFUs i kontrollen vid fem timmar. Också, cirka 4%återhämtning observerades betydligt lägre än kontrollen.Sammantaget visar dessa data att stam två ut konkurrerade referensstammen genom att döda sina celler. Det viktigaste steget i detta förfarande är att uppnå rätt startförhållande eftersom det kan påverka resultaten avsevärt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Kolonisering av Euprymna scolopes Squid genom Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Övervakning dendritceller Migration hjälp<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analys av vidhäftning under Shear stress för studier av T-lymfocyter-adhesionsmolekyl interaktioner

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Utveckling av en känsligare och mer specifik kromogena Agar Medium för detektion av<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Och annat<em&gt; Vibrio</em&gt; Arter

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratoriemetoder som används för att upprätthålla och differentiera biotyper av<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Kliniska och miljömässiga isoleringar

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induktion av cellulär differentiering och enkelcellsimaging av<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Simmare och svavelceller

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Ex Vivo Infektion av mänskliga lymfoida vävnad och kvinnliga genitala slemhinnan med humant immunbristvirus 1 och Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Kvantifiera Vibriocholerae koloniseringen och diarré hos vuxna zebrafisk modellen

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...