Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0103200)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81671734)، والمشاريع الرئيسية لبرنامج تيانجين لدعم العلوم والتكنولوجيا (18YFZCSY00010)، وصناديق البحوث الأساسية ل الجامعات المركزية (63191155). نحن نعترف بمراجعات غلوريا نانس، التي كانت قيمة في تحسين نوعية مخطوطتنا.

ويجب أن تمتثل التجارب للوائح الوطنية والمؤسسية المتعلقة باستخدام الحيوانات لأغراض البحث. يجب الحصول على أذونات لإجراء التجارب. وتلتزم معالجة الحيوانات والإجراءات التجريبية للدراسة بالمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نانكاي التي تتوافق مع المبادئ التوجيهية لر...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

في هذا البروتوكول، يتم وصف نهج BLI المزدوج غير الغازية لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية. تم تطوير نظام مراسل BLI لأول مرة، الذي يحتوي على جين الانتحار HSV-ttk/GCV لتتبع تطور الورم والانحدار في الجسم الحي عن طريق التصوير Rluc. وفي الوقت نفسه، يتم تقييم تكوين الأوعية الدموية الورم باستخدام الفئ?...

تكوين الأوعية هو عملية أساسية في تطور السرطان من الأورام الصغيرة المترجمة إلى أكبر، يحتمل أن تكون الأورام النقيلية1،2. يصبح الارتباط بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية إحدى نقاط التركيز في مجال أبحاث الأورام. ومع ذلك، تفشل الطرق التقليدية لقياس التغيرات المورفولوجية في رصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد في الحيوانات الحية باستخدام نهج مرئي.
التصوير الإنارة الحيوية (BLI) من الخلايا السرطانية هو طريقة تجريبية مناسبة بشكل خاص لرصدنمو الورم بسبب عدم الغازية، والحساسية، والخصوصية 3،4،5،6 . وتستند تكنولوجيا BLI على مبدأ أن لوسيفيراز يمكن أن تحفز أكسدة الركيزة محددة في حين تنبعث منها الإنارة الحيوية. وluciferase أعرب في الخلايا السرطانية المزروعة يتفاعل مع الركيزة حقن، والتي يمكن الكشف عنها من قبل نظام التصوير الحي، وإشارات تعكس بشكل غير مباشر التغيرات في عدد الخلايا أو توطين الخلايا في الجسم الحي6،7.
باستثناء نمو الورم، يمكن أيضا تصور تكوين الأوعية الدموية الورم (الخطوة الحرجة في تطور السرطان) من خلال تكنولوجيا BLI باستخدام Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا8،9،10. عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (Vegf) مستقبلات 2 (Vegfr2)، وهو نوع واحد من مستقبلات Vegf، وأعرب في الغالب في الخلايا البطانية الوعائية من الفئران الكبار11. في Vegfr2-Fluc-KI الفئران المعدلة وراثيا، يتم ضرب تسلسل الحمض النووي من لوسيفيراز اليراع (Fluc) في الطارد الأول من تسلسل Vegfr2 الذاتية. ونتيجة لذلك، يتم التعبير عن المداخن (التي تظهر كإشارات BLI) بطريقة مطابقة لمستوى تكوين الأوعية الدموية في الفئران. لتنمو أكثر من بضعة ملليمترات في الحجم، والورم يجند الأوعية الدموية الجديدة من الأوعية الدموية القائمة، والتي تعبر بشكل كبير عن Vegfr2 الناجمة عن عوامل النمو من الخلايا السرطانية1. وهذا يفتح إمكانية استخدام الفئران المعدلة وراثيا Vegfr2-Fluc-KI لمراقبة غير الغازية تكوين الأوعية الدموية الورم من قبل BLI.
في هذا البروتوكول، يتم إنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم لرصد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في ماوس واحد من خلال التصوير اليراعة لوسيفيراز (Fluc) ورينيلا لوسيفيراز (Rluc)، على التوالي (الشكل 1). يتم إنشاء خط خلية 4T1 (4T1-RR) الذي يعبر بشكل كبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر وRluc (RFP) لتتبع نمو الخلايا عن طريق التصوير Rluc. لمزيد من التحقيق في التغيرات الديناميكية في تكوين الأوعية الدموية في تطور وتراجع الورم، يتم إنشاء خط خلية 4T1 آخر (4T1-RRT) الذي يعبر عن الانتحار الجينات الهربس البسيط فيروس اقتطاع كيناز الثيميدين (HSV-ttk)، Rluc، وRFP. بإدارة غانسيكلوفير (GCV)، يتم إلغاء الخلايا التعبير ية HSV-ttk بشكل انتقائي. استنادا ً إلى خطوط الخلايا هذه، تم بناء نموذج يحمل الورم في فئران Vegfr2-Fluc-KI التي تعمل كنموذج تجريبي لسد تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

تكوين الأوعية الدموية، كعملية حاسمة من تطور الورم، أصبح نقطة ساخنة البحوث وهدفا للعلاج المضادة للورم. ومع ذلك، لا يوجد نموذج موثوق به لتتبع تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في وقت واحد بطريقة بصرية وحساسة. يعرض التصوير الإنارة الحيوية تفوقها الفريد في التصوير الحي بسبب مزاياه من الحساسية العالية، والخصوصية القوية، والقياس الدقيق. يقدم هنا بروتوكول لإنشاء نموذج الماوس الحاملة للورم عن طريق حقن رينلا لوسيفيراز المسمى خط خلية سرطان الثدي مورين 4T1 في الماوس المعدلة وراثيا مع الأوعية الدموية الناجمة عن التعبير اليراعة لوسيفيراز. يوفر نموذج الماوس هذا أداة قيمة لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير ثنائي الإضاءة الحيوية في ماوس واحد. ويمكن تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وبحوث الأورام.

في هذه التجربة، تم إنشاء نموذج الماوس سرطان الثدي باستخدام خلايا 4T1 للتحقيق في العلاقة بين نمو الورم وتكوين الأوعية الدموية الورم (الشكل 1). أولاً، تم تعبئة فيروسين من فيروس اللانتي، يحملان تسلسلات جينية تعبر عن Rluc/RFP (LV-RR) وRluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT)، على التوالي، كما أ...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

التصوير الإنارة الحيوية المزدوجة لتقدم الورم وتكوين الأوعية الدموية

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير الغمر الحيوي المزدوج.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

تولد الأوعية يلعب دورا هاما في ورم الانبثاث والتقدم. في هذا البروتوكول، سوف نستخدم أسلوب التصوير البيوجيني المزدوج لرصد تطور الورم الديناميكي وتسيس الأوعية الدموية في نموذج فأرة سرطان الثدي. في هذا النموذج، يمكننا تتبع نمو الورم و تسيس الأوعية في وقت واحد في الماوس واحد من خلال لوسيفراز اليراعات ورينيلا لوسيفراز التصوير، على التوالي.قد يتم تطبيق هذا النموذج على نطاق واسع في فحص الأدوية المضادة للورم وأبحاث الأورام. يمكن استخدام هذا النموذج المزدوج للتخمة الحيوية لتتبع تطور الورم وتراجعه والكشف عن العمليات الجزيئية المرتبطة بالورم استجابة للاستراتيجيات العلاجية. Angiogenesis هو عملية حاسمة من تطور الورم.لذلك ، من الضروري مراقبة تطور الورم وتولد الأوعية بطريقة مرئية وحساسة لتطوير علاجات الورم الفعالة. وسوف تظهر الإجراءات من قبل كايو تشانغ، تشن وانغ، وشانغ تشن، والطلاب من مختبرنا. للتعبئة والتغليف والبذور إنتاج الفيروس العدسي مرة واحدة 10 إلى السادسة من الخلايا 293T في مليلتر اثنين من DMEM تكملها مع مصل الأبقار الجنين 10٪ في بئر في لوحة ستة جيدا لثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.في صباح اليوم التالي مزيج 7.5 ميكرولترات من liposome مع 250 ميكرولترات من الحد الأدنى من الضروري المتوسطة في اثنين من أنابيب منفصلة 1.5 ملليلتر لمدة خمس دقائق الحضانة في درجة حرارة الغرفة. لإعداد حلول الحمض النووي إضافة ناقلات RR فيروس العدس وbnasmids المساعد إلى 250 ميكرولترات من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية في أنابيب فردية 1.5 ملليلتر كما هو مبين في الجدول. في نهاية الحضانة بلطف إضافة الحمض النووي RR حلول لتعليق liposome بطريقة قطرة الحكيمة والسماح للحمض النووي للارتباط إلى الأغشية الدهنية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.في حين أن الخليط هو احتضان، استبدال نابير من ثقافة الخلايا 293T مع ملليلتر واحد من الثقافة الطازجة المتوسطة، وإضافة بلطف 0.5 ملليلتر من خليط الحمض النووي الدهني المناسب لكل بئر. إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة 12 إلى 16 ساعة قبل استبدال المابير في كل بئر بميليلتر واحد من وسط الثقافة الطازجة تكملها المضادات الحيوية. بعد 36 ساعة إضافية من الحضانة، تجمع المابس في أنبوب واحد مخروطي لكل سلالة من فيروسات العدس إلى رواسب الخلايا 293T عن طريق الطرد المركزي.ثم نقل RR فيروس العدس التي تحتوي على RR كبرى في الفردية 1.5 ملليلتر أنابيب تخزين البولي بروبلين معقمة للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. بالنسبة لتحولات الخلايا العضدية للتعبير الجيني في خلايا الورم الثديي 4T1، استبدل المابير في كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 4T1 ذات الستة بئرًا بميليلتر واحد من ثقافة الخلايا الطازجة المستندة إلى RPMI والمكملة بمصل الأبقار الجنينية ومليلتر واحد من مخزون العدسي. ثم إضافة ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من بوليبرين إلى كل بئر، وماصة بلطف عدة مرات لخلط.الطرد المركزي لوحة للمساعدة في زيادة كفاءة النقل، وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع إلى 12 ساعة. في نهاية الحضانة، استبدال نابيرات في كل بئر مع ثقافة جديدة المتوسطة تستكمل مع المصل والمضادات الحيوية لإزالة أي جزيئات العدس وبوليبرين. لتحديد للخلايا التي يسببها فيروس العدس، مرور الثقافات خلية 4T1 المستحثة بنسبة واحد إلى ثلاثة إلى واحد إلى أربعة مع متوسط الاختيار، وتغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام.بعد سبعة أيام من اختيار ثقافة متوسطة، عرض الثقافات الخلية المستحثة تحت المجهر الفلوري المقلوب المرحلة التباين وحص عدد من أحمر فلورية إيجابية البروتين أو RFP-4T1 الخلايا وجميع الخلايا 4T1 في ثلاثة مجالات الرؤية لتقدير نسبة RFP إيجابية. لإعداد نموذج الماوس الحاملة للورم، غسل 80٪ التقاء الثقافات الخلية المنقولة مع برنامج تلفزيوني قبل فصل الخلايا مع ملليلتر اثنين من التربسين-EDTA لكل لوحة ثقافة 60 ملليمتر. عندما رفعت الخلايا من قيعان لوحة وقف التفاعل مع خمسة إلى 10 ملليلتر من المصل تكمل المتوسطة لكل لوحة.ونقل الثقافات إلى أنابيب فردية للطرد المركزي 15 ملليلتر للعد. تمييع الخلايا إلى مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل 100 ميكرولترات من المتوسطة الثقافة دون تركيز المصل. وحقن تحت الجلد 100 ميكرولترات من خط الخلية 4T1-RR في الكتف الأيسر من الماوس نموذج تحمل الورم تخدير، و 100 ميكرولترات من خط الخلية 4T1-RRT في الكتف الأيمن من نفس الماوس.بعد الحقن، ضع كل فأرة في منطقة استرداد مناسبة مع دعم حراري حتى يتم استردادها بالكامل. بالباتات كتلة الورم كل يوم لمدة سبعة أيام للتأكد من أن الفئران هي تحمل الورم. في اليوم السابع بعد الزرع، يحقن داخل الصفتون 50 ميكروغرام لكل كيلوغرام من غانسيكلوفير في كل فأر يحمل الورم مرتين في اليوم حتى نهاية التجربة.لنمو الورم، افتح نظام التصوير الحي. تهيئة برنامج التصوير الحية و تهيئة النظام. في حين أن النظام هو تهيئة، واستخدام حقنة الأنسولين لحقن كل فأرة ليكون صورة مع حجم مناسب من coelenterazine في الرجعية.ضع الفئران المحقونة في غرفة الكاميرا والحصول على الفور عدة صور للماوس dorsally للحصول على إشارات رينيها لوسيفراز من خلايا 4T1 حتى تتلاشى إشارات الإضاءة الحيوية. بعد 10 دقائق من التصوير في رينايلا لوسيفيراز، استخدم حقنة الأنسولين لحقن داخل الصفاق حجم مناسب من D-luciferin في كل. بعد 10 دقائق من حقن D-luciferin، ضع الفئران في غرفة الكاميرا والحصول على عدة صور من دورسال الماوس للحصول على إشارات اليراعات من تولد الأوعية الدموية.بعد تحويل الفيروس العدسي، أكثر من 99٪ من الخلايا هي RFP إيجابية مع عدم وجود اختلافات في مورفولوجيا ثقافة الخلية لوحظ بين خطي الخلية المستحثة. في وقت لاحق، يكشف تصوير الإضاءة الحيوية للخلايا المستحثة أن كلا الخطين من الخلايا ينبعث من إشارات إنارة حيوية قوية لقوة مماثلة. بعد الحقن تحت الجلد من خطوط الخلايا المستحثة في نموذج الماوس الحاملة للورم، يمكن تقييم نمو الورم الناجم عن تولد الأوعية بواسطة إشارات اليراعات في وجود D-luciferin في نفس الحيوان.في سبعة أيام بعد زرع, إدارة Ganciclovir يحفز الموت في خلايا 4T1-RRT مما أدى إلى انخفاض كبير في إشارة لوسيفراز رينيه في الأورام التي أنشأتها هذه الخلايا. إشارات اليراعات لوسيفراز زيادة أيضا بالتزامن مع زيادة في التعبير luciferase رينايلا وانخفاض بعد انخفاض لوسيفراز. معا، هذه النتائج تشير إلى أن هناك علاقة مباشرة بين تولد الأوعية الورم ونمو الورم.في الواقع، قد يؤدي موت الخلايا السرطانية الناجم عن غانسيكلوفير إلى تثبيط تولد الأوعية الدموية. علاوة على ذلك، المناعة لمستقبِل عامل النمو البطواني المضاد للأوعية الدموية II، كعلامة على تكوين الأوعية الدموية، يكشف عن بنية الأوعية الدموية الدقيقة المنشأة بشكل أكبر في أقسام أنسجة الورم 4T1-RR مما كانت عليه في أقسام من أورام 4T1-RRT، بما يتفق مع الانخفاض في إشارة اليرافلية التي لوحظت بعد إدارة غانتسيلوار. الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو استخدام نوعين من لوسيفراز، مثل FLuc وRLuc لتتبع في وقت واحد من الخلايا و الأوعية الدموية.ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا لعلاج الخلايا السرطانية داخل مواقع مختلفة، ويمكن استخدامها على نطاق واسع في نماذج سرطان الفيروس. هذا النموذج الماوس السماح نمو الورم والآثار المضادة للورم من نظام تتبع HSV-ttk/GCV أن تصور بشكل حيوي في حي. مطلوب مرفق من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية لمنع العدوى بفيروس العدس، حيث تحتوي الوسائط على جزيئات فيروس العدس التي يمكن أن تكون ضارة للبشر.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

وضع مزدوج تصوير الأنسجة الجلدية الأكسجة وظيفة الأوعية الدموية

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

رصد الانبثاث ورم والآفات الحالة للعظم مع ضوء بارد ، والتصوير المقطعي مايكرو

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

في الجسم الحي التصوير المزدوج الركيزة Bioluminescent

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

في الجسم الحي التصوير من ورم الأوعية الدموية باستخدام الإسفار متحد البؤر Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

رواية عالية الدقة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنية التصوير لدراسة الاستجابة الديناميكية للمنشآت داخل القحف لنمو الورم والتداوي

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

شبكية العين مفرزة النموذجي في القوارض بواسطة حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

المبيضات البيض بيوفيلم التنمية على الهيئات الأجنبية طبيا ذات الصلة في الماوس تحت الجلد نموذج تلاه ضوء بارد التصوير

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

إنشاء طعم أجنبي نموذج المايلوما المتعددة الإنسان في الدجاج لدراسة نمو الورم والغزو والأوعية الدموية

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...