Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af National Key R & D program i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation of China (81671734), og centrale projekter i Tianjin Science and Technology support program (18YFZCSY00010), grundlæggende forskningsmidler til de centrale universiteter (63191155). Vi anerkender Gloria Nance revisioner, som var værdifulde for at forbedre kvaliteten af vores manuskript.

Forsøgene skal være i overensstemmelse med nationale og institutionelle bestemmelser om anvendelse af dyr til forskningsformål. Der skal indhentes tilladelser til at udføre eksperimenter. Behandlingen af dyr og eksperimentelle procedurer i undersøgelsen overholde Nankai University Animal Care og brug Komité retningslinjer, der er i overensstemmelse med de retningslinjer for dyrepleje godkendt af National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) og LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentivira...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

I denne protokol er der beskrevet en ikke-invasiv Dual BLI-tilgang til overvågning af tumor udvikling og angiogenese. BLI reporter-systemet er først udviklet og indeholder HSV-TTK/GCV-selvmords genet til sporing af tumorprogression og regression i vivo af Rluc Imaging. I mellemtiden, tumor angiogenese er vurderet ved hjælp af Vegfr2-Fluc-KI mus via Fluc Imaging. Denne tumor-bærende musemodel er i stand til at give en praktisk platform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor udvikling og tumor angiogenese af Du...

Angiogenese er en vigtig proces i progression af kræft fra små, lokaliserede neoplasmer til større, potentielt metastaserende tumorer1,2. Sammenhængen mellem tumorvækst og angiogenese bliver et af de punkter af vægt på området onkologiske forskning. Men, traditionelle metoder til måling morfologiske ændringer undlader at overvåge tumorprogression og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjælp af en visualiseret tilgang.
Bioluminescens Imaging (bli) af tumorceller er en særlig hensigtsmæssig Eksperimentel metode til at overvåge tumorvækst på grund af dens ikke-invasivitet, følsomhed, og specificitet3,4,5,6 . BLI-teknologien er baseret på princippet om, at der kan katalysere oxidation af et specifikt substrat, mens det udsender bioluminescens. Der udtrykt i implanterede tumorceller reagerer med det injicerede substrat, som kan påvises ved en levende billeddannelse system, og signaler indirekte afspejler ændringerne i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.
Bortset fra tumorvækst, tumor angiogenese (det kritiske trin i kræft progression) kan også visualiseres gennem bli-teknologi ved hjælp af Vegfr2-fluc-ki Transgene mus8,9,10. Den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), en type VEGF-receptor, er for det meste udtrykt i de vaskulære endotelceller af voksne mus11. I Vegfr2-fluc-ki Transgene mus, er DNA-sekvensen af Firefly der (fluc) slået ind i den første exon af den endogene Vegfr2 sekvens. Som følge heraf udtrykkes fluc (som optræder som bli-signaler) på en måde, der er identisk med niveauet af angiogenese i mus. At vokse ud over et par millimeter i størrelse, tumoren rekruttorer nye vasculatures fra eksisterende blodkar, som stærkt udtrykker Vegfr2 udløst af vækstfaktorer fra tumorceller1. Dette åbner mulighed for at bruge Vegfr2-fluc-ki Transgene mus til ikke-invasivt overvåge tumor angiogenese af bli.
I denne protokol, en tumor-bærende musemodel er etableret for at overvåge tumorprogression og angiogenese i en enkelt mus gennem Firefly der (fluc) og renilla der (rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er skabt, der stabilt udtrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) til at spore cellevækst ved Rluc Imaging. For yderligere at undersøge de dynamiske ændringer af angiogenese i progression og regression af tumoren, er en anden 4T1 cellelinje (4T1-RRT) skabt, der udtrykker selvmords genet herpes simplex virus trunkeret thymidinkinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administration af ganciclovir (GCV) er HSV-TTK-ekspor tcellerne selektivt. Baseret på disse cellelinjer, en tumor-bærende model i Vegfr2-fluc-ki mus er bygget, der fungerer som en eksperimentel model bridging tumorprogression og tumor angiogenese in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Angiogenesis, som en afgørende proces af tumorprogression, er blevet en forskning hotspot og mål for anti-tumor terapi. Men, der er ingen pålidelig model til sporing af tumorprogression og angiogenese samtidig på en visuel og følsom måde. Bioluminescens Imaging viser sin unikke overlegenhed i levende billeddannelse på grund af sine fordele ved høj følsomhed, stærk specificitet og nøjagtig måling. Præsenteret her er en protokol til at etablere en tumor-bærende musemodel ved at injicere en renilla der-mærket murine brystkræft cellelinje 4t1 ind i den Transgene mus med angiogenesis-induceret Firefly der udtryk. Denne musemodel giver et værdifuldt værktøj til samtidig at overvåge tumorprogression og angiogenese i realtid ved Dual bioluminescens Imaging i en enkelt mus. Denne model kan være almindeligt anvendt i anti-tumor Drug screening og onkologiske forskning.

I dette eksperiment, en brystkræft musemodel blev etableret ved hjælp af 4T1 celler til at undersøge forholdet mellem tumorvækst og tumor angiogenese (figur 1). For det første blev to lentivirus pakket, som førte gensekvenser, der udtrykker henholdsvis Rluc/RFP (LV-RR) og Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), som tidligere rapporteret7. Derefter blev to forskellige 4T1-cellelinjer, der hedder 4T1-RR og 4T1-RRT, oprettet ved at transducere h...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Dual bioluminescens billeddannelse af tumor progression og Angiogenesis

Denne protokol beskriver etableringen af en tumor-bærende musemodel til at overvåge tumorprogression og angiogenese i realtid ved Dual bioluminescens Imaging.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Angiogenese spiller en vigtig rolle i tumormetastase og progression. I denne protokol, Vi vil bruge dobbelt bioluminescens imaging metode til at overvåge den dynamiske tumor progression og angiogenese i en musemodel af brystkræft. I denne model, Vi kan spore tumorvækst og angiogenese samtidig i den enkelte mus gennem Firefly luciferase og Renilla luciferase imaging, henholdsvis.Denne model kan anvendes i vid udstrækning i antitumor drug screening og onkologi forskning. Denne dobbelte bioluminescens model kan bruges til at spore tumor progression og regression og til at opdage tumor-relaterede molekylære processer som reaktion på terapeutiske strategier. Angiogenese er en afgørende proces af tumor progression.Derfor, overvågning tumor progression og angiogenese i en visuel og følsom måde er nødvendig for at udvikle effektive tumor behandlinger. Procedurerne vil blive demonstreret af Kaiyue Zhang, Chen Wang, og Shang Chen, studerende fra vores laboratorium. For lentivirusemballage og -produktionsfrø en gang 10 til sjette af 293T-celler i to milliliter DMEM suppleret med 10 % føtalt kvægserum pr. brønd i en seks-brøndsplade til nattens dyrkning i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid.Den næste morgen mix 7,5 mikroliter liposom med 250 mikroliter minimal essential medium i to separate 1,5-milliliter rør i en fem minutters inkubation ved stuetemperatur. For at forberede DNA-løsninger tilføje plasmid lentivirus RR vektor og hjælper plasmider til 250 mikroliter minimal essential medium i individuelle 1,5-milliliter rør som skitseret i tabellen. I slutningen af inkubationen forsigtigt tilføje DNA RR løsninger til liposom suspensioner i en dråbe-klog måde og lad DNA til at binde sig til lipid membraner i 20 minutter ved stuetemperatur.Mens blandingen er inkuberende, erstatte supernatant af 293T cellekultur med en milliliter frisk kultur medium, og forsigtigt tilføje 0,5 milliliter af den relevante liposom DNA blanding til hver brønd. Returner cellerne til cellekulturinkubatoren i 12 til 16 timer, før supernatanten udskiftes i hver brønd med en milliliter frisk kulturmedium suppleret med antibiotika. Efter yderligere 36 timers inkubation samles supernatanterne i et konisk rør pr. lentivirusstamme for at sedimentere 293T-cellerne ved centrifugering.Derefter overføres lentivirus RR-holdige supernatanter til individuelle 1,5 milliliter sterile polypropylenopbevaringsrør til opbevaring ved minus 80 grader Celsius. For lentiviral transduktion for genekspression i 4T1 mammary tumorceller, erstatte supernatant i hver brønd af en seks-brønd 4T1 celle kultur plade med en milliliter frisk RPMI-baserede cellekultur medium suppleret med føtal kvæg serum og en milliliter lentiviral bestand. Derefter tilsættes otte mikrogram pr. milliliter polybren til hver brønd, og pipette et par gange for at blande.Centrifuge pladen til at bidrage til at øge transduktion effektivitet, og returnere cellerne til cellekultur inkubator i fire til 12 timer. Ved slutningen af inkubationen erstattes supernatanten i hver brønd med frisk dyrkningsmedium suppleret med serum og antibiotika for at fjerne eventuelle lentivirale partikler og Polybrene. Hvis du vil vælge for lentivirus-transduced celler, passage af transduced 4T1 cellekulturer på en-til-tre til en-til-fire forhold med udvælgelse medium, ændre mediet hver to til tre dage.Efter syv dages udvælgelsesmediumkultur ses de transducedcellekulturer under et fluorescensineret fasekontrastmikroskop og tælle antallet af røde fluorescerende proteinpositive celler eller RFP-4T1-celler og alle 4T1-cellerne i tre synsfelter for at anslå RFP-positiv-forholdet. For at oprette en tumorbærende musemodel vaskes 80% sammenløbet transduced cellekulturer med PBS, før cellerne tages af med to milliliter trypsin-EDTA pr. 60-millimeter kulturplade. Når cellerne er løftet fra pladebundene, stopper reaktionen med fem til 10 milliliter serum suppleret medium pr. plade.Og overføre kulturerne til individuelle 15-milliliter centrifuge rør til optælling. Cellerne fortyndes til en gang 10 til de sjette celler pr. 100 mikroliter af dyringsmedie uden serumkoncentration. Og subkutant injicere 100 mikroliter af 4T1-RR celle linje i venstre skulder af en bedøvet tumor-bærende model mus, og 100 mikroliter af 4T1-RRT celle linje i højre skulder af samme mus.Efter injektionerne skal hver mus placeres i et passende genvindingsområde med termisk støtte, indtil den er helt genoprettet. Palpate tumor masserne hver dag i syv dage for at bekræfte, at musene er tumor-bærende. På dag syv post-implantation, intraperitoneally injicere 50 mikrogram pr kg Ganciclovir i hver tumor-bærende mus to gange om dagen indtil udgangen af forsøget.For tumorvækst, åbne Living Imaging System. Initialiser Living Imaging-softwaren, og initialiser systemet. Mens systemet initialiserer, skal du bruge en insulinsprøjte til at injicere hver mus, der skal afbildes med den passende mængde coelenterazin i reflekslinjen.Placer de injicerede mus i kamerakammeret og straks få flere billeder af musen dorsally at erhverve Renilla luciferase signaler fra 4T1 celler, indtil bioluminescerende signaler fade væk. 10 minutter efter Renilla luciferase-billeddannelsen skal du bruge en insulinsprøjte til intraperitoneally at injicere den passende mængde D-luciferin i hvert dyr. 10 minutter efter D-luciferin injektion, placere mus i kameraet kammer og få flere billeder af musen dorsal at erhverve Firefly luciferase signaler fra angiogenese.Efter lentivirustransduktion er mere end 99 % af cellerne RFP-positive uden forskelle i cellekulturmorfologien observeret mellem de to transduced cellelinjer. Efterfølgende, bioluminescens billeddannelse af de transduced celler afslører, at begge cellelinjer udsender stærke bioluminescerende signaler af en lignende styrke. Efter subkutan injektion af de transduced cellelinjer i en transgen tumor-bærende musemodel, angiogenese-induceret tumorvækst kan evalueres ved Firefly luciferase signaler i overværelse af D-luciferin i samme dyr.På syv dage efter implantation, Ganciclovir administration inducerer død i 4T1-RRT celler resulterer i en dramatisk reduktion i Renilla luciferase signal i tumorer etableret af disse celler. Firefly luciferase signaler også stige i forbindelse med en stigning i Renilla luciferase udtryk og fald efter luciferase tilbagegang. Tilsammen, disse resultater tyder på, at der er en direkte sammenhæng mellem tumor angiogenese og tumorvækst.Faktisk, Ganciclovir-induceret tumor celledød kan føre til en hæmning af tumor angiogenese. Yderligere, immunostaining for anti-vaskulære endotel vækstfaktor receptor II, som en markør for angiogenese, afslører en mere signifikant etableret mikrovaskulær struktur i 4T1-RR tumorvæv sektioner end i sektioner fra 4T1-RRT tumorer, i overensstemmelse med faldet i Fire luciflyferase signal observeret efter Ganciclovir administration. Det mest kritiske trin i protokollen er ved hjælp af to slags luciferase, såsom FLuc og RLuc til samtidig sporing af cellerne og angiogenese.Denne teknologi kan bruges til behandling af kræftceller inden for forskellige steder, og det kan bruges bredt i virus kræft modeller. Denne mus model tillader tumorvækst og anti-tumor effekter af HSV-ttk/GCV tracking system, der skal visualiseres dynamisk i et levende dyr. En biosikkerhed niveau II facilitet er nødvendig for at forhindre en lentivirus transfektion, da medierne indeholder lentivirus partikler, der kan være skadelige for mennesker.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D live-cell imaging af tumor: mikromiljø interaktioner, Impact malignt Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo billeddannelse af tumorangiogenese hjælp Fluorescens Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Høj opløsning<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknik til at undersøge den dynamiske respons af Intrakranielle Structures til tumorvækst og Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Udvikling om medicinsk relevante fremmedlegemer i en mus Subkutan Model Efterfulgt af Bioluminescens Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Etablering af en human myelomatose xenograftmodel i kylling til Studieinformationen tumorvækst, invasion og angiogenese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...