Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door National key R & D-programma van China (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation of China (81671734), en belangrijke projecten van het Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (63191155). We erkennen de herzieningen van Gloria Nance, die waardevol waren om de kwaliteit van ons manuscript te verbeteren.

Experimenten moeten voldoen aan de nationale en institutionele voorschriften betreffende het gebruik van dieren voor onderzoeksdoeleinden. Er moeten machtigingen voor het uitvoeren van experimenten worden verkregen. De behandeling van dieren en experimentele procedures van de studie houden aan de Nankai University dierenverzorging en gebruik Comité richtlijnen die voldoen aan de richtlijnen voor de verzorging van dieren goedgekeurd door de National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

In dit protocol wordt een niet-invasieve dubbele BLI-benadering beschreven voor het monitoren van tumor ontwikkeling en angiogenese. Het BLI reporter systeem wordt voor het eerst ontwikkeld, met het HSV-ttk/GCV Suicide gen voor het volgen van tumorprogressie en regressie in vivo door Rluc Imaging. Ondertussen wordt tumor angiogenese beoordeeld met behulp van Vegfr2-Fluc-KI muizen via Fluc Imaging. Dit tumor-lager muismodel is in staat om een praktisch platform te bieden voor continue en niet-invasieve tracking tumor ontw...

Angiogenese is een essentieel proces in de progressie van kanker van kleine, gelokaliseerde Neoplasmata tot grotere, mogelijk gemetastaseerde tumoren1,2. De correlatie tussen tumorgroei en angiogenese wordt een van de punten van de nadruk op het gebied van oncologie onderzoek. Traditionele methoden voor het meten van morfologische veranderingen zijn echter niet in staat om de tumorprogressie en angiogenese gelijktijdig in levende dieren te monitoren met behulp van een gevisualiseerde benadering.
Bioluminescentie Imaging (bli) van tumorcellen is een bijzonder geschikte experimentele methode om de tumorgroei te monitoren vanwege de niet-invasiviteit, gevoeligheid en specificiteit3,4,5,6 . Bli-technologie is gebaseerd op het principe dat de plaats oxidatie van een specifiek substraat kan katalyseren tijdens het uitzenden van bioluminescentie. De plaats uitgedrukt in geïmplanteerde tumorcellen reageert met het geïnjecteerde substraat, dat kan worden gedetecteerd door een levend beeld systeem, en signalen weerspiegelen indirect de veranderingen in het celnummer of cellokalisatie in vivo6,7.
Met uitzondering van tumorgroei, kan tumor angiogenese (de kritieke stap in de progressie van kanker) ook worden gevisualiseerd via bli-technologie met behulp van Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen8,9,10. De vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) receptor 2 (Vegfr2), één type VEGF-receptor, wordt meestal uitgedrukt in de vasculaire endotheliale cellen van volwassen muizen11. In Vegfr2-Fluc-Ki transgene muizen wordt de DNA-sequentie van Firefly plaats (Fluc) in de eerste Exon van de endogene Vegfr2 sequentie geslagen. Als gevolg hiervan wordt de Fluc uitgedrukt (die verschijnt als BLI-signalen) op een manier die identiek is aan het niveau van angiogenese bij muizen. Om te groeien dan een paar millimeter in grootte, de tumor rekruten nieuwe vasculaturen van bestaande bloedvaten, die sterk uitdrukken de Vegfr2 veroorzaakt door groeifactoren uit tumorcellen1. Dit opent de mogelijkheid van het gebruik van Vegfr2-Fluc-KI transgene muizen tot niet-invasief monitoren van tumor angiogenese door BLI.
In dit protocol, een tumor-dragende muismodel is opgericht om te controleren van de tumorprogressie en angiogenese in een enkele muis door middel van Firefly plaats (Fluc) en renilla plaats (rluc) Imaging, respectievelijk (Figuur 1). Er wordt een 4T1-cellijn (4T1-RR) gemaakt dat Rluc en Red fluorescent proteïne (RFP) stabiel uitdrukt om celgroei te traceren door Rluc Imaging. Om verder onderzoek te doen naar de dynamische veranderingen van angiogenese in de progressie en regressie van de tumor, wordt een andere 4T1 cellijn (4T1-RRT) gemaakt die het zelfmoord genherpes simplexvirus (afgekort thymidine kinase, HSV-ttk), Rluc en RFP uitdrukt. Door toediening van ganciclovir (GCV), wordt de HSV-ttk die cellen uitdrukt, selectief geablleerd. Op basis van deze cellijnen is een tumor lager model in Vegfr2-Fluc-KI muizen gebouwd dat dient als een experimenteel model dat de tumorprogressie en tumor angiogenese in vivo overbrugt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Angiogenese, als een cruciale proces van tumorprogressie, is uitgegroeid tot een onderzoek hotspot en doelwit van anti-tumor therapie. Er is echter geen betrouwbaar model voor het traceren van tumorprogressie en angiogenese tegelijkertijd op een visuele en gevoelige manier. Bioluminescentie Imaging toont zijn unieke superioriteit in levende beeldvorming vanwege de voordelen van hoge gevoeligheid, sterke specificiteit en nauwkeurige meting. Gepresenteerd hier is een protocol om een tumor-dragende muismodel te vestigen door het injecteren van een renilla plaats-gelabelde Murine borstkanker cellijn 4t1 in de transgene muis met angiogenese-geïnduceerde Firefly plaats expressie. Dit muismodel biedt een waardevol hulpmiddel om gelijktijdig tumorprogressie en angiogenese in real-time te monitoren door dubbele bioluminescentie beeldvorming in één muis. Dit model kan op grote schaal worden toegepast in anti-tumor drug screening en oncologie onderzoek.

In dit experiment, een borstkanker muismodel werd opgericht met behulp van 4T1 cellen te onderzoeken van de relatie tussen tumorgroei en tumor angiogenese (Figuur 1). Ten eerste werden twee linvirussen verpakt, die gensequenties droegen die Rluc/RFP (LV-RR) en Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) uitmaakten, zoals eerder gemeld7. Vervolgens werden twee verschillende 4T1 cellijnen, genaamd 4T1-RR en 4T1-RRT, gemaakt door respectievelijk transducin...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Dubbele bioluminescentie beeldvorming van tumor progressie en angiogenese

Dit protocol beschrijft de oprichting van een tumor-lager muismodel om te controleren van de progressie van de tumor en angiogenese in real-time door dubbele bioluminescentie beeldvorming.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Angiogenese spelen een belangrijke rol bij tumormetastase en progressie. In dit protocol zullen we de dual bioluminescentie beeldvormingsmethode gebruiken om de dynamische tumorprogressie en angiogenese te monitoren in een muismodel van borstkanker. In dit model kunnen we de tumorgroei en angiogenese gelijktijdig in de enkele muis volgen via respectievelijk Firefly luciferase en Renilla luciferase imaging.Dit model kan op grote schaal worden toegepast in antitumor drug screening en oncologie onderzoek. Dit duale bioluminescentiemodel kan worden gebruikt om tumorprogressie en regressie te volgen en tumorgerelateerde moleculaire processen te detecteren in reactie op therapeutische strategieën. Angiogenese is een cruciaal proces van tumorprogressie.Daarom is het monitoren van tumorprogressie en angiogenese op een visuele en gevoelige manier noodzakelijk voor het ontwikkelen van effectieve tumorbehandelingen. De procedures zullen worden aangetoond door Kaiyue Zhang, Chen Wang, en Shang Chen, studenten van ons lab. Voor lentivirusverpakkingen en productiezaad één keer 10 tot de zesde van 293T-cellen in twee milliliter DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum per goed in een zesputige plaat voor nachtkweek in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.De volgende ochtend meng 7,5 microliter liposoom met 250 microliter van Minimal Essential Medium in twee afzonderlijke 1,5-milliliter buizen voor een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur. Ter voorbereiding van de DNA-oplossingen voeg de plasmid lentivirus RR vector en helper plasmiden tot 250 microliter van Minimal Essential Medium in individuele 1,5-milliliter buizen zoals beschreven in de tabel. Voeg aan het einde van de incubatie voorzichtig de DNA RR-oplossingen op een druppelvormige manier toe aan de liposoomsusiesus en laat het DNA 20 minuten bij kamertemperatuur aan de lipidemembranen binden.Terwijl het mengsel is incubatie, vervang de supernatant van de 293T celcultuur met een milliliter van verse cultuur medium, en voorzichtig voeg 0,5 milliliter van de juiste liposoom DNA mengsel aan elke put. Breng de cellen terug naar de celkweek incubator voor 12 tot 16 uur voor het vervangen van de supernatant in elke put met een milliliter verse cultuur medium aangevuld met antibiotica. Na een extra 36 uur incubatie, pool de supernatants in een conische buis per lentivirus stam sediment de 293T cellen door centrifugatie.Breng vervolgens de lentivirus RR-bevattende supernatants over in individuele 1,5 milliliter steriele polypropyleenopslagbuizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Voor lentivirale transductie voor genexpressie in 4T1 borsttumorcellen, vervang de supernatant in elke put van een zes-goed 4T1 celkweekplaat door een milliliter van verse RPMI-gebaseerde celkweekmedium aangevuld met foetaal boviene serum en een milliliter van lentivirale voorraad. Voeg vervolgens acht microgram per milliliter polybrene aan elke put, en voorzichtig pipette een paar keer te mengen.Centrifuge de plaat om te helpen de transductie-efficiëntie te verhogen, en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator voor vier tot 12 uur. Vervang aan het einde van de incubatie het supernatant in elke put door vers kweekmedium aangevuld met serum en antibiotica om lentivirale deeltjes en Polybrene te verwijderen. Om te selecteren voor de lentivirus-getransduceerde cellen, passage de getransduceerde 4T1 celculturen op een een-op-drie tot een-vier verhouding met selectiemedium, het veranderen van het medium om de twee tot drie dagen.Bekijk na zeven dagen van selectiemediumcultuur de getransduceerde celculturen onder een fluorescentie omgekeerde fasecontrastmicroscoop en tel het aantal rode fluorescerende eiwitpositieve of RFP-4T1 cellen en alle 4T1-cellen in drie gezichtsvelden om de RFP-positieve verhouding te schatten. Om een tumordragend muismodel op te zetten, was je 80%confluent transduced cell cultures met PBS voordat je de cellen losmaakt met twee milliliter trypsine-EDTA per 60-millimeter kweekplaat. Wanneer de cellen zijn opgeheven van de plaat bodems stoppen met de reactie met vijf tot 10 milliliter serum aangevuld medium per plaat.En breng de culturen in individuele 15-milliliter centrifugebuizen voor het tellen. Verdun de cellen tot een een keer 10 tot de zesde cellen per 100 microliter van cultuurmedium zonder serumconcentratie. En onderhuids injecteren 100 microliter van de 4T1-RR cellijn in de linkerschouder van een verdoofde tumordragende modelmuis, en 100 microliter van de 4T1-RRT cellijn in de rechterschouder van dezelfde muis.Na de injecties plaatst u elke muis in een geschikt herstelgebied met een thermische ondersteuning totdat deze volledig hersteld is. Palpate de tumor massa's elke dag gedurende zeven dagen om te bevestigen dat de muizen zijn tumor-dragende. Op dag zeven na de implantatie injecteer intraperitoneally 50 microgram per kilogram Ganciclovir in elke tumordragende muis twee keer per dag tot het einde van het experiment.Open voor tumorgroei het Living Imaging System. Initialiseer de Living Imaging software en initialiseer het systeem. Terwijl het systeem is initialiseren, gebruik dan een insulinespuit om elke muis te injecteren om te worden afgebeeld met de juiste hoeveelheid coelenterazine in de retrobulbar.Plaats de geïnjecteerde muizen in de camerakamer en krijg onmiddellijk verschillende foto's van de muis dorsaal om de Renilla luciferase signalen van 4T1 cellen te verwerven totdat de bioluminescente signalen vervagen. 10 minuten na de Renilla luciferase beeldvorming, gebruik een insulinespuit om intraperitoneally injecteren van de juiste volume van D-luciferin in elk dier. 10 minuten na de D-luciferin injectie, plaats de muizen in de camerakamer en krijg verschillende beelden van de muis rug om de Firefly luciferase signalen van angiogenese te verwerven.Na de transductie van lentivirus is meer dan 99% van de cellen RFP-positief zonder verschillen in de celcultuurmorfologie waargenomen tussen de twee getransduceerde cellijnen. Vervolgens blijkt uit bioluminescentiebeeldvorming van de doorgeïnduceerde cellen dat beide cellijnen sterke bioluminescente signalen van een vergelijkbare sterkte uitzenden. Na onderhuidse injectie van de getransduceerde cellijnen in een transgeen tumordragend muismodel, kan de door angiogenese geïnduceerde tumorgroei worden geëvalueerd door Firefly luciferase signalen in aanwezigheid van D-luciferin bij hetzelfde dier.Op zeven dagen na de implantatie, Ganciclovir toediening induceert de dood in de 4T1-RRT cellen wat resulteert in een dramatische vermindering van de Renilla luciferase signaal in de tumoren vastgesteld door deze cellen. Firefly luciferase signalen nemen ook toe in combinatie met een toename van de Renilla luciferase expressie en daling als gevolg van luciferase daling. Samen suggereren deze resultaten dat er een directe correlatie is tussen tumorangogenese en tumorgroei.Inderdaad, Ganciclovir-geïnduceerde tumorceldood kan leiden tot een remming van tumor angiogenese. Verder, immunostaining voor anti-vasculaire endotheelgroeifactor receptor II, als een marker van angiogenese, onthult een meer significant gevestigde microvasculaire structuur in 4T1-RR tumorweefsel secties dan in secties van 4T1-RRT tumoren, in overeenstemming met de daling van Firefly luciferase signaal waargenomen na Ganciclovir toediening. De meest kritieke stap van het protocol is het gebruik van twee soorten luciferase, zoals FLuc en RLuc voor gelijktijdige tracking van de cellen en de angiogenese.Deze technologie kan worden gebruikt voor de behandeling van kankercellen op verschillende locaties, en het kan op grote schaal worden gebruikt in viruskanker modellen. Dit muismodel waardoor de tumorgroei en de anti-tumor effecten van het HSV-ttk/GCV tracking systeem dynamisch kunnen worden gevisualiseerd in een levend dier. Een bioveiligheid niveau II faciliteit is nodig om een lentivirus transfectie te voorkomen, omdat de media lentivirus deeltjes die schadelijk kunnen zijn voor de mens bevat.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Dual-mode beeldvorming van Cutane zuurstofvoorziening van de weefsels en de vaatfunctie

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Monitoring tumormetastasen en osteolytische laesies met bioluminescentie en Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual ondergrond Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netvliesloslating Model in Knaagdieren door Subretinal Injectie van natriumhyaluronaat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Oprichting van een Human Multiple Myeloma Xenograft Model in de Chicken tumorgroei, invasie en Angiogenese Studie

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...