Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2017YFA0103200), הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (81671734), ופרויקטים מרכזיים של טיינג'ין המדע וטכנולוגיה תוכנית תמיכה (18YFZCSY00010), קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (63191155). אנו מכירים בשינויים של גלוריה נאנס, שהיו יקרי ערך בשיפור איכות כתב היד שלנו.

ניסויים חייבים לעמוד בתקנות לאומיות ומוסדיים הנוגעות לשימוש בבעלי חיים לצורכי מחקר. יש להשיג הרשאות לביצוע ניסויים. הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים של המחקר לדבוק באוניברסיטאות Nankai טיפול בעלי חיים והנחיות הוועדה להשתמש הנחיות ההנחיות לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי המכון הלאומי לבר?...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

בפרוטוקול זה, הגישה ללא פולשני כפול מתואר מחוץ לתחום הפיתוח של הגידול והאנגיוגנזה. מערכת העיתונאי בלי להיות מפותח לראשונה, המכיל את הגן HSV-ttk/GCV התאבדות עבור מעקב התקדמות הגידול ורגרסיה ב vivo ידי Rluc הדמיה. בינתיים, הגידול אנגיוגנזה מוערך באמצעות Vegfr2-Fluc-KI עכברים באמצעות הדמיה Fluc. זה הגידול מוד?...

אנגיוגנזה הוא תהליך חיוני בהתקדמות של סרטן מ קטן, ניפלאמים מקומיים לגדול, פוטנציאל גידולים גרורות1,2. הקורלציה בין צמיחת הגידול והאנגיוגנזה הופכת לאחת מנקודות ההדגשה בתחום המחקר האונקולוגי. עם זאת, שיטות מסורתיות של מדידת שינויים מורפולוגיים לא לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו זמנית בחיות חיים באמצעות גישה דמיינו.
ביולומינסנציה הדמיה (בלי) של תאים סרטניים היא שיטה ניסויית המתאימה במיוחד כדי לפקח על צמיחת הגידול בגלל החלטיות שלה לא פולשני, רגישות, וספציפיות3,4,5,6 . טכנולוגיית בלי מבוססת על העיקרון כי לוציפראז יכול לזרז חמצון של מצע ספציפי תוך פליטת ביולומינציה. ללוציפראז הביע בתאי הגידול מושתל מגיב עם המצע מוזרק, אשר ניתן לזהות על ידי מערכת הדמיה חיה, אותות בעקיפין לשקף את השינויים מספר התא או לוקליזציה תא ב vivo6,7.
למעט צמיחת הגידול, הגידול אנגיוגנזה (הצעד הקריטי בהתקדמות הסרטן) יכול גם להיות מדמיין דרך הטכנולוגיה בלי להשתמש בעכבר Vegfr2-fluc-KI הטרנסגניים8,9,10. מקדם הצמיחה של כלי הדם (הקולטן) 2 (Vegfr2), סוג אחד של קולטן, מתבטא בעיקר בתאי כלי הדם של עכברים למבוגרים11. ב-Vegfr2-Fluc-KI העכברים, רצף ה-DNA של גחלילית לוציפראז (Fluc) הוא דפק לתוך האקסון הראשון של הרצף האנדודוגני Vegfr2. כתוצאה מכך, ה-Fluc מתבטא (המופיעה כאותות בלי מלים) באופן זהה לרמת האנגיוגנזה בעכברים. כדי לצמוח מעבר כמה מילימטרים בגודל, הגידול מגייס ואסיקולטרים חדשים מכלי הדם הקיימים, אשר מאוד לבטא את Vegfr2 המופעל על ידי גורמי גדילה מתאי הגידול1. זה פותח את האפשרות של שימוש Vegfr2-Fluc-KI העכברים הטרנסגניים כדי שאינו פולשני לפקח על אנגיוגנזה הגידול על ידי בלי.
בפרוטוקול זה, מודל העכבר נושאת הגידול הוא הוקם כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בעכבר אחד באמצעות לוציו גחלילית (fluc) ו renilla ללוציפראז (rluc) הדמיה, בהתאמה (איור 1). קו תא 4T1 (4T1-RR) נוצר באופן מאוד מבטא Rluc וחלבון פלורסנט אדום (RLUC) כדי לעקוב אחר צמיחת תאים על ידי הדמיה Rluc. כדי לחקור עוד יותר את השינויים הדינמיים של אנגיוגנזה בהתקדמות ורגרסיה של הגידול, קו תא 4t1 נוסף (4t1-rrt) נוצר כי המבטא התאבדות גן הרפס וירוס מעוגל תימידין קינאז (HSV-ttk), rrt, ו-rrt. על-ידי המינהל של ganciclovir (GCV), את HSV-ttk המבטא תאים הם באופן סלקטיבי הקשורים. בהתבסס על קווי תאים אלה, מודל הנושאת גידול בעכברים Vegfr2-Fluc-KI בנוי המשמש כמודל ניסיוני גישור התקדמות הגידול והגידול אנגיוגנזה בvivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

אנגיוגנזה, כתהליך מכריע של התקדמות הגידול, הפך נקודה חמה מחקר היעד של טיפול נגד הגידול. עם זאת, אין מודל אמין לעקיבה אחר התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בו באופן חזותי ורגיש. הדמיה ביולומינסנציה מציגה את עליונותה הייחודית בהדמיית חיים בשל יתרונותיה של רגישות גבוהה, ספציפיות ומדידה מדויקת. הציג כאן הוא פרוטוקול כדי להקים מודל הנושא הגידול העכבר על ידי הזרקת Renilla לוציפראז התווית מורטין סרטן השד קו 4T1 לתוך העכבר טרנסגניים עם המושרה אנגיוגנזה הבעה לוציפראז. מודל זה של העכבר מספק כלי יקר ערך בו לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול בעכבר בודד. מודל זה עשוי להיות נרחב להחיל הקרנת תרופות נגד הגידול ואונקולוגיה מחקר.

בניסוי זה, סרטן השד מודל העכבר הוקמה באמצעות תאים 4T1 כדי לחקור את הקשר בין גידול גידול והגידול אנגיוגנזה (איור 1). ראשית, שני הנגיף היו ארוזים, אשר נשאו רצפי גנים המבטא Rluc/RLUC (LV-RR) ו Rluc/RLUC/HSV-ttk (LV-RLUC), בהתאמה, כפי שדווח בעבר7. לאחר מכן, שני שונים תא 4T1 ק?...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

אנגיוגנזה לשחק תפקיד חשוב גרורות הגידול והתקדמות. בפרוטוקול זה, נשתמש בשיטת הדמיה ביולומינציה כפולה כדי לפקח על התקדמות הגידול הדינמי ואנגיוגנזה במודל עכבר של סרטן השד. במודל זה, אנו יכולים לעקוב אחר הגידול ואנגיוגנזה בו זמנית בעכבר יחיד דרך Firefly luciferase ורניה לוציפראז הדמיה, בהתאמה.מודל זה עשוי להיות מיושם באופן נרחב בהקרנת תרופות antitumor ומחקר אונקולוגי. מודל ביולומינציה כפול זה יכול לשמש כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול רגרסיה ולזהות תהליכים מולקולריים הקשורים לגידול בתגובה לאסטרטגיות טיפוליות. אנגיוגנזה היא תהליך מכריע של התקדמות הגידול.לכן, ניטור התקדמות הגידול ואנגיוגנזה באופן חזותי ורגיש יש צורך בפיתוח טיפולים יעילים בגידול. ההליכים יוכחו על ידי קאיו זאנג, צ'ן וונג ושאנג צ'ן, סטודנטים מהמעבדה שלנו. לאריזת lentivirus וזרעי ייצור פעם אחת 10 עד השישית של 293T תאים בשני מיליליטר של DMEM בתוספת 10% סרום לב עוברי לתוך צלחת שש באר לתרבות לילה באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.למחרת בבוקר לערבב 7.5 microliters של ליפוזום עם 250 microliters של מדיום חיוני מינימלי בשני צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר. כדי להכין את פתרונות ה-DNA להוסיף את וקטור RR lentivirus פלסמיד ופלסמיד עוזר 250 microliters של מדיום חיוני מינימלי צינורות בודדים 1.5 מיליליטר כפי שמתואר בטבלה. בסוף הדגירה מוסיפים בעדינות את פתרונות ה- DNA RR להשעיות ליפוזום בצורה רכה ומאפשרים לדנ"א להתחבר למברנות השומנים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.בעוד התערובת היא דגירה, להחליף את supernatant של תרבות התא 293T עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי, בעדינות להוסיף 0.5 מיליליטר של תערובת DNA ליפוזום המתאים לכל באר. מחזירים את התאים לחממת תרבות התאים למשך 12 עד 16 שעות לפני החלפת העל-טבעי בכל באר במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי בתוספת אנטיביוטיקה. לאחר 36 שעות נוספות של דגירה, בריכת supernatants לתוך צינור חרוט אחד לכל זן lentivirus כדי להכביד על התאים 293T על ידי צנטריפוגה.לאחר מכן העבר את lentivirus RR המכיל עלנטנטים לתוך צינורות אחסון פוליפרופילן סטריליים בודדים 1.5 מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. עבור lentiviral transduction עבור ביטוי גנים בתאי גידול 4T1 mammary, להחליף את supernatant בכל באר של שישה בארות 4T1 צלחת תרבות התא עם מיליליטר אחד של טרי RPMI מבוססי תאים בינוני בתוספת סרום לב העובר אחד מיליליטר של מלאי lentiviral. לאחר מכן מוסיפים שמונה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברין לכל באר, ובעדינות פיפטה כמה פעמים כדי לערבב.צנטריפוגה הצלחת כדי לעזור להגדיל את יעילות ההתמרה, ולהחזיר את התאים החממה תרבות התא במשך ארבע עד 12 שעות. בסוף הדגירה, להחליף את supernatant בכל באר עם בינוני תרבות טרי בתוספת סרום ואנטיביוטיקה כדי להסיר את כל החלקיקים lentiviral ו Polybrene. כדי לבחור עבור התאים שתומרו על-ידי lentivirus, מעבר בין תרבות התאים המומרים של 4T1 ביחס של אחד לשלוש עד אחד עד ארבעה עם מדיום הבחירה, ומשנה את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.לאחר שבעה ימים של בחירה בתרבות בינונית, הצג את תרבות התאים המתומרות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך פלואורסצנטי וספירת מספר תאי החלבון הפלורסנט האדומים החיוביים או RFP-4T1 ואת כל תאי ה- 4T1 בשלושה תחומי ראייה כדי להעריך את היחס החיובי RFP. כדי להקים מודל עכבר נושא גידול, לשטוף תרבות תאים מתמרים 80%confluent עם PBS לפני ניתוק התאים עם שני מיליליטר של טריפסין-EDTA לכל צלחת תרבות 60 מילימטר. כאשר התאים הרימו מהתחתית צלחת לעצור את התגובה עם חמישה עד 10 מיליליטר של סרום בתוספת בינוני לכל צלחת.ולהעביר את התרבויות לצינורות צנטריפוגה בודדים של 15 מיליליטר לספירה. מדללים את התאים לתאים פי 10 עד השישי לכל 100 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי ללא ריכוז סרום. ובאופן תת עורי להזריק 100 microliters של קו התא 4T1-RR לתוך הכתף השמאלית של עכבר מודל נושא גידול הרדמה, ו 100 microliters של קו התא 4T1-RRT לתוך הכתף הימנית של אותו עכבר.לאחר הזריקות, מניחים כל עכבר באזור התאוששות מתאים עם תמיכה תרמית עד להחלמה מלאה. יש למפות את גושי הגידול כל יום במשך שבעה ימים כדי לאשר שהעכברים נושאים גידולים. ביום שבע לאחר ההשתלה, להזריק תוך-אפית 50 מיקרוגרם לקילוגרם של Ganciclovir לתוך כל עכבר נושא גידול פעמיים ביום עד סוף הניסוי.לגידול הגידול, פתחו את מערכת ההדמיה החיה. אתחל את תוכנת ההדמיה החיה ואתחל את המערכת. בזמן שהמערכת מאתחלת, השתמש במזרק אינסולין כדי להזריק כל עכבר כדי לדמיין אותו עם הנפח המתאים של קולנטראזין לתוך הרטרובולבר.מניחים את העכברים מוזרק לתוך תא המצלמה מיד להשיג כמה תמונות של העכבר dorsally לרכוש את אותות רנילה לוציפראז מתאי 4T1 עד אותות bioluminescent לדעוך. 10 דקות לאחר הדמיה רנילה לוציפראז, להשתמש מזרק אינסולין להזריק תוך-אפית את הנפח המתאים של D-luciferin לתוך כל חיה. 10 דקות לאחר הזרקת D-luciferin, למקם את העכברים לתוך תא המצלמה ולקבל כמה תמונות של הגב העכבר לרכוש את אותות לוציפראז פיירפלי מאנגיוגנזה.לאחר ההתמרה lentivirus, יותר מ 99% מהתאים הם RFP חיובי ללא הבדלים מורפולוגיה של תאים שנצפו בין שני קווי התאים מתומרים. לאחר מכן, דימות ביולומינציה של התאים המתומרים מגלה כי שני קווי התא פולטים אותות ביולומינסנטיים חזקים בעוצמה דומה. לאחר הזרקה תת עורית של קווי התאים המתומרים למודל עכבר נושא גידול מהומר, צמיחת גידול הנגרמת על ידי אנגיוגנזה ניתן להעריך על ידי אותות לוציפראז פיירפלי בנוכחות D-לוסיפרין באותה חיה.בשבעה ימים לאחר ההשתלה, ממשל Ganciclovir גורם למוות בתאי 4T1-RRT וכתוצאה מכך ירידה דרמטית באותות רנה לוציפראז בגידולים שנקבעו על ידי תאים אלה. אותות לוציפראז גחלילית גם להגדיל בשילוב עם עלייה בביטוי רנילה לוציפראז וירידה בעקבות ירידה לוציפראז. יחד, תוצאות אלה מראות כי יש מתאם ישיר בין אנגיוגנזה הגידול וצמיחה הגידול.אכן, מוות תאי הגידול הנגרמת על ידי Ganciclovir עלול להוביל לעיכוב של אנגיוגנזה הגידול. כמו כן, immunostaining עבור קולטן גורם גדילה אנדותל נגד כלי דם II, כסמן של אנגיוגנזה, חושף מבנה מיקרו-וסקולרי מבוסס יותר באופן משמעותי בסעיפים רקמת גידול 4T1-RR מאשר בחלקים מגידולים 4T1-RRT, עולה בקנה אחד עם הירידה בסימן Luciferase פיירפלי נצפתה לאחר ממשל Ganciclovir. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא שימוש בשני סוגים של לוציפראז, כגון FLuc ו- RLuc למעקב בו זמנית של התאים והאנגיוגנזה.טכנולוגיה זו יכולה לשמש לטיפול בתאים סרטניים במקומות שונים, וזה יכול לשמש נרחב במודלים סרטן וירוס. מודל העכבר הזה מאפשר לצמיחת הגידול ואת ההשפעות האנטי-סרטניות של מערכת המעקב HSV-ttk/GCV להיות חזותי באופן דינמי בבעל חיים חי. מתקן ביוספטי ברמה II נדרש כדי למנוע transfection lentivirus, כמו התקשורת מכילה חלקיקי lentivirus שעלולים להזיק לבני אדם.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Dual-mode הדמיה של חמצון רקמות עורית ועל תפקוד כלי הדם

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

ניטור גרורות סרטן ונגעים Osteolytic עם פליטת אור CT ו - Micro Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

מיים מודלים של הדמיה חיה של תאים 4D גידול: אינטראקציות microenvironment המשפיעים ממאירה התקדמות

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

בהדמית vivo של אנגיוגנזה גידול באמצעות הקרינה Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...