Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av National Key R & D-programmet i Kina (2017YFA0103200), National Natural Science Foundation i Kina (81671734), og viktige prosjekter i Tianjin Science and Technology Support program (18YFZCSY00010), grunnleggende Research Funds for de sentrale universitetene (63191155). Vi anerkjenner Gloria vedlikeholds revisjoner, som var verdifulle i å forbedre kvaliteten på manuskriptet vårt.

Eksperimenter må være i samsvar med nasjonale og institusjonelle bestemmelser om bruk av dyr til forskningsformål. Tillatelser til å utføre eksperimenter må innhentes. Behandlingen av dyr og eksperimentelle prosedyrer av studien overholder Nankai University Animal Care og bruk komité retningslinjer som samsvarer med retningslinjene for Animal Care godkjent av National Institutes of Health (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) og LV-Rluc-RFP-HSV-TTK (RRT) lentiviral emballasje og produksjon
<p cl...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

I denne protokollen er en ikke-invasiv dual BLI-tilnærming beskrevet for overvåking av tumor utvikling og angiogenese. BLI reporter systemet er først utviklet, som inneholder HSV-TTK/GCV selvmords genet for sporing av tumorprogresjon og regresjon i vivo av Rluc Imaging. I mellomtiden er tumor angiogenese vurderes ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI mus via svingninger Imaging. Denne svulst bærende musen modellen er i stand til å gi en praktisk plattform for kontinuerlig og ikke-invasiv sporing tumor utvikling og tumo...

Angiogenese er en viktig prosess i utviklingen av kreft fra små, lokaliserte svulster til større, potensielt metastatisk svulster1,2. Sammenhengen mellom tumor vekst og angiogenese blir en av punktene i vekt på feltet av onkologi forskning. Men tradisjonelle metoder for å måle morfologiske endringer mislykkes i å overvåke tumorprogresjon og angiogenese samtidig i levende dyr ved hjelp av en visualisere tilnærming.
Bioluminesens Imaging (bli) av tumorceller er en spesielt hensiktsmessig eksperimentell metode for å overvåke tumor vekst på grunn av sin ikke-invasiveness, følsomhet, og spesifisitet3,4,5,6 . BLI-teknologi er basert på prinsippet om at luciferase kan katalysere oksidasjon av et bestemt substrat mens emitting bioluminesens. Luciferase uttrykt i implantert tumorceller reagerer med injisert substrat, som kan oppdages av en levende Imaging system, og signaler indirekte reflekterer endringene i celle nummer eller celle lokalisering i vivo6,7.
Med unntak av tumor vekst, kan tumor angiogenese (det kritiske trinnet i kreft progresjon) også bli visualisere gjennom bli-teknologi ved hjelp av Vegfr2-svingninger-KI transgene Mouse8,9,10. Den vaskulære endothelial vekstfaktor (Vegf) reseptor 2 (Vegfr2), en type Vegf reseptor, er stort sett uttrykt i den vaskulære endothelial celler av voksne mus11. I Vegfr2-svingninger-KI transgene mus blir DNA-sekvensen av Firefly luciferase (svingninger) slått inn i den første ekson av den endogene Vegfr2 sekvensen. Som et resultat, svingninger uttrykkes (som vises som BLI-signaler) på en måte som er identisk med nivået av angiogenese i mus. Å vokse utover noen få millimeter i størrelse, den tumor rekrutterer nye vasculatures fra eksisterende blodårer, som svært uttrykker Vegfr2 utløst av vekstfaktorer fra tumorceller1. Dette åpner muligheten for å bruke Vegfr2-svingninger-KI transgene mus til ikke-invasivt overvåke tumor angiogenese av BLI.
I denne protokollen, er en tumor-bærende mus modell etablert for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i en enkelt mus gjennom Firefly luciferase (svingninger) og Renilla luciferase (Rluc) Imaging, henholdsvis (figur 1). En 4T1 cellelinje (4T1-RR) er opprettet som stabilt uttrykker Rluc og rødt fluorescerende protein (RFP) å spore cellevekst ved Rluc Imaging. For ytterligere å undersøke dynamiske endringer av angiogenese i progresjon og regresjon av svulsten, en annen 4T1 cellelinje (4T1-RRT) er opprettet som uttrykker selvmords genet herpes simplex virus avkortet tymidin kinase (HSV-TTK), Rluc, og RFP. Ved administrering av ganciklovir (GCV), HSV-TTK uttrykker celler er selektivt ablated. Basert på disse cellelinjer, en svulst-bærende modell i Vegfr2-svingninger-KI mus er bygget som fungerer som en eksperimentell modell bygge bro tumorprogresjon og tumor angiogenese in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

Angiogenese, som en viktig prosess med tumorprogresjon, har blitt et forsknings-hotspot og mål for anti-tumor terapi. Det er imidlertid ingen pålitelig modell for sporing tumorprogresjon og angiogenese samtidig i en visuell og følsom måte. Bioluminesens Imaging viser sin unike overlegenhet i levende Imaging på grunn av sine fordeler med høy følsomhet, sterk spesifisitet, og nøyaktig måling. Presentert her er en protokoll for å etablere en tumor-bærende mus modell ved å injisere en Renilla luciferase-merket murine brystkreft cellelinje 4T1 i transgene mus med Angiogenese-indusert Firefly luciferase uttrykk. Denne musen modell skaffer en kostbar verktøyet å samtidig dataskjerm svulst progresjon og angiogenese inne virkelig-tid av dobbelt bioluminesens tenkelig inne en enkelt musen. Denne modellen kan bli mye brukt i anti-tumor narkotika screening og onkologi forskning.

I dette eksperimentet ble en brystkreft mus modell etablert ved hjelp av 4T1 celler for å undersøke forholdet mellom tumor vekst og tumor angiogenese (figur 1). For det første ble to lentivirus pakket, som bar gen sekvenser uttrykker Rluc/RFP (LV-RR) og Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), henholdsvis som tidligere rapportert7. Så, to annerledes 4T1 cellen linjer, benevnt 4T1-RR og 4T1-RRT, var skapt av transducing LV-RR og LV-RRT respective...

Watch this Scientific Journal Video about Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis at JoVE.com

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Dual bioluminesens Imaging av tumor progresjon og angiogenese

Denne protokollen beskriver etablering av en tumor-bærende mus modell for å overvåke tumorprogresjon og angiogenese i sanntid av dual bioluminesens Imaging.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Angiogenese spiller viktig rolle i tumormetastase og progresjon. I denne protokollen vil vi bruke dobbel bioluminescence imaging metode for å overvåke dynamisk tumorprogresjon og angiogenese i en musemodell av brystkreft. I denne modellen kan vi spore tumorvekst og angiogenese samtidig i den ene musen gjennom Henholdsvis Firefly luciferase og Renilla luciferase.Denne modellen kan brukes mye i antitumor narkotika screening og onkologi forskning. Denne doble bioluminescensmodellen kan brukes til å spore tumorprogresjon og regresjon og for å oppdage tumorrelaterte molekylære prosesser som svar på terapeutiske strategier. Angiogenese er en avgjørende prosess med tumorprogresjon.Derfor er overvåking av tumorprogresjon og angiogenese på en visuell og sensitiv måte nødvendig for å utvikle effektive tumorbehandlinger. Prosedyrene vil bli demonstrert av Kaiyue Zhang, Chen Wang, og Shang Chen, studenter fra vårt laboratorium. For lentivirus emballasje og produksjon frø en ganger 10 til den sjette av 293T celler i to milliliter DMEM supplert med 10% fosterbovin serum per godt inn i en seks-brønns plate for overnatting kultur i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Neste morgen bland 7,5 mikroliter liposom med 250 mikroliter minimalt essensiell medium i to separate 1,5-milliliter rør i fem minutters inkubasjon ved romtemperatur. For å forberede DNA-løsningene tilsett plasmid lentivirus RR vektor og hjelper plasmider til 250 mikroliter minimalt essensiell medium i individuelle 1,5-milliliter rør som beskrevet i tabellen. På slutten av inkubasjonen forsiktig legge DNA RR løsninger til liposomet suspensjoner på en drop-wise måte og la DNA å binde seg til lipid membraner i 20 minutter ved romtemperatur.Mens blandingen inkuberer, erstatt supernatanten til 293T-cellekulturen med en milliliter frisk kulturmedium, og tilsett forsiktig 0,5 milliliter av riktig liposom DNA-blanding til hver brønn. Returner cellene til cellekulturinkubatoren i 12 til 16 timer før du erstatter supernatanten i hver brønn med en milliliter frisk kulturmedium supplert med antibiotika. Etter ytterligere 36 timers inkubasjon, pool supernatants i ett konisk rør per lentivirus belastning for å sediment 293T cellene ved sentrifugering.Overfør deretter lentivirus RR-inneholdende supernatanter til individuelle 1,5-milliliter sterile polypropylenlagringsrør for lagring ved minus 80 grader Celsius. For lentiviral transduksjon for genuttrykk i 4T1 brysttumorceller, erstatt supernatant i hver brønn av en seks-brønns 4T1 cellekulturplate med en milliliter fersk RPMI-basert cellekulturmedium supplert med fosterbovinserum og en milliliter lentiviral lager. Tilsett deretter åtte mikrogram per milliliter polybrene til hver brønn, og pipett forsiktig et par ganger for å blande.Sentrifuger platen for å øke transduksjonseffektiviteten, og returner cellene til cellekulturinkubatoren i fire til 12 timer. På slutten av inkubasjonen erstatter du supernatanten i hver brønn med friskt kulturmedium supplert med serum og antibiotika for å fjerne eventuelle lentiviralpartikler og polybrene. For å velge for lentivirus-transduserte celler, passere de transduserte 4T1 cellekulturene i et ett til tre til en-til-fire-forhold med utvalgsmedium, og endre mediet hver to til tre dager.Etter syv dager med utvalgsmediumkultur, se de transduserte cellekulturene under et fluorescensinvertert fasekontrastmikroskop og telle antall røde fluorescerende proteinpositive eller RFP-4T1-celler og alle 4T1-cellene i tre synsfelt for å estimere RFP-positivt forhold. For å sette opp en tumorbærende musemodell, vask 80% sammenføyde transduserte cellekulturer med PBS før du løsner cellene med to milliliter trypsin-EDTA per 60-millimeter kulturplate. Når cellene har løftet fra platebunnen, stopp reaksjonen med fem til 10 milliliter serumsupplert medium per plate.Og overfør kulturene til individuelle 15-milliliter sentrifugerør for telling. Fortynn cellene til en gang 10 til de sjette cellene per 100 mikroliter kulturmedium uten serumkonsentrasjon. Og subkutant injisere 100 mikroliter av 4T1-RR cellelinjen i venstre skulder av en bedøvet tumorbærende modell mus, og 100 mikroliter av 4T1-RRT cellelinjen inn i høyre skulder av samme mus.Etter injeksjonene, plasser hver mus i et passende gjenopprettingsområde med termisk støtte til den er helt gjenopprettet. Palper tumormassene hver dag i syv dager for å bekrefte at musene er tumorbærende. På dag syv post-implantasjon, intraperitoneally injisere 50 mikrogram per kilo Ganciclovir i hver tumorbærende mus to ganger per dag til slutten av eksperimentet.For tumorvekst, åpne Living Imaging System. Initialiser Living Imaging-programvaren og initialiser systemet. Mens systemet initialiserer, bruk en insulinsprøyte til å injisere hver mus som skal avbildes med riktig volum coelenterazin i retrobulbar.Plasser de injiserte musene i kamerakammeret og få umiddelbart flere bilder av musen dorsally for å skaffe Renilla luciferase signaler fra 4T1 celler til bioluminescerende signaler falmer bort. 10 minutter etter renilla luciferase avbildning, bruk en insulinsprøyte til intraperitoneally injisere riktig volum av D-luciferin i hvert dyr. 10 minutter etter D-luciferin injeksjon, plasser musene i kamerakammeret og få flere bilder av musen dorsal å skaffe Firefly luciferase signaler fra angiogenese.Etter lentivirustransduksjon er mer enn 99% av cellene RFP-positive uten forskjeller i cellekulturmorfologien observert mellom de to transduserte cellelinjene. Deretter avslører bioluminescensavbildning av de transduserte cellene at begge cellelinjene avgir sterke bioluminescerende signaler av lignende styrke. Etter subkutan injeksjon av de transduserte cellelinjene i en transgen tumorbærende musemodell, kan angiogenese-indusert tumorvekst evalueres av Firefly luciferasesignaler i nærvær av D-luciferin i samme dyr.Ved syv dagers post-implantasjon induserer Ganciclovir-administrasjonen død i 4T1-RRT-cellene, noe som resulterer i en dramatisk reduksjon i Renilla luciferasesignalet i svulstene etablert av disse cellene. Firefly luciferase signaler også øke i forbindelse med en økning i Renilla luciferase uttrykk og nedgang etter luciferase nedgang. Samlet, disse resultatene tyder på at det er en direkte sammenheng mellom tumor angiogenese og tumorvekst.Faktisk kan Ganciclovir-indusert tumorcelledød føre til en hemming av tumorangogenese. Videre, immunostaining for anti-vaskulær endotelvekstfaktor reseptor II, som en markør for angiogenese, avslører en mer betydelig etablert mikrovaskulær struktur i 4T1-RR tumorvev seksjoner enn i seksjoner fra 4T1-RRT svulster, i samsvar med nedgangen i Firefly luciferase signalisert etter Ganciclovir administrasjon. Det mest kritiske trinnet i protokollen er å bruke to typer luciferase, for eksempel FLuc og RLuc for samtidig sporing av cellene og angiogenesen.Denne teknologien kan brukes til å behandle kreftceller på forskjellige steder, og den kan brukes mye i viruskreftmodeller. Denne musemodellen slik at tumorvekst og anti-tumor effekter av HSV-ttk / GCV sporingssystem som skal visualiseres dynamisk i et levende dyr. Et biosikkerhetsnivå II-anlegg er nødvendig for å forhindre en lentivirustransfeksjon, da mediet inneholder lentiviruspartikler som kan være skadelige for mennesker.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Monitoring Tumor Metastases and Osteolytic Lesions with Bioluminescence and Micro CT Imaging

Following intracardiac delivery of MDA-MB-231-luc-D3H2LN cells to Nu/Nu mice, systemic metastases developed in the injected animals. Bioluminescence ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

Mame Modeller for 4D Live-celle Imaging av tumor: mikromiljøet interaksjoner som Impact Ondartet Progresjon

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo avbildning av tumor angiogenese med fluoresens Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel Høy oppløsning<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging teknikk for å studere den dynamiske respons Intrakraniale Structures til tumorvekst og Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netthinneavløsning Model i Gnagere etter subretinal Injeksjon av Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development på medisinsk-relevante Fremmedlegemer i en mus Subkutan Model Etterfulgt av Bioluminesens Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Etablering av et menneske multippelt myelom Xenotransplantat Model i Chicken å studere tumorvekst, invasjon og Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...