Name: dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00
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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de chave nacional R & D da China (2017YFA0103200), Fundação Nacional de ciência natural da China (81671734), e projetos-chave do programa de apoio à ciência e tecnologia de Tianjin (18YFZCSY00010), fundos de pesquisa fundamentais para Universidades centrais (63191155). Reconhecemos as revisões da Gloria Nance, que foram valiosas para melhorar a qualidade do nosso manuscrito.

Os experimentos devem obedecer aos regulamentos nacionais e institucionais relativos ao uso de animais para fins de pesquisa. As permissões para realizar experimentos devem ser obtidas. O tratamento dos animais e os procedimentos experimentais do estudo aderem às diretrizes da Comissão de cuidados e uso de animais da Universidade Nankai, que estão em conformidade com as diretrizes para a assistência aos animais aprovadas pelos institutos nacionais de saúde (NIH).
1. LV-Rluc-RFP (RR) e LV-R...

<ol>
	<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li><li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence.">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li><li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity.">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC.">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006 (2008).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence.">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li><li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis,+from+foe+to+friend.">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment.">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer.">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis.">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li><li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response.">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li><li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer.">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li><li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread.">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li><li>Mezzanotte, L., van &#39;t Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging:+New+Tools+and+Applications.">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li><li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy.">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+biodistribution,+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers.">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li><li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments.">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li><li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+&amp;#34;red-shifted&amp;#34;+luciferase.">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &amp;#34;red-shifted&amp;#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571 (2013).</li></ol>

Neste protocolo, uma aproximação dupla não invasora de BLI é descrita para monitorar o desenvolvimento e a angiogênese do tumor. O sistema do repórter de BLI é desenvolvido primeiramente, contendo o gene do suicídio de HSV-TTK/GCV para seguir a progressão do tumor e a regressão in vivo pela imagem latente de Rluc. Enquanto isso, a angiogênese tumoral é avaliada usando camundongos Vegfr2-Fluc-KI via imagem Fluc. Este modelo do rato do tumor-rolamento é capaz de fornecer uma plataforma prática para o desenvol...

A angiogênese é um processo essencial na progressão do câncer de neoplasias pequenas e localizadas para tumores maiores e potencialmente metastáticos1,2. A correlação entre o crescimento tumoral e a angiogênese torna-se um dos pontos de ênfase no campo da pesquisa oncológica. Entretanto, os métodos tradicionais de medir mudanças morfológicas não conseguem monitorar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em animais vivos usando uma aproximação visualizada.
A imagem de bioluminescência (bli) de células tumorais é um método experimental particularmente apropriado para monitorar o crescimento tumoral por causa de sua não-invasividade, sensibilidade e especificidade3,4,5,6 . A tecnologia de BLI é baseada no princípio que o luciferase pode catalisar a oxidação de um substrato específico ao emitir o bioluminescence. A luciferase expressa em células tumorais implantadas reage com o substrato injetado, que pode ser detectado por um sistema de imagem vivo, e os sinais refletem indiretamente as alterações no número de células ou na localização da célula in vivo6,7.
Com exceção do crescimento tumoral, a angiogênese tumoral (o passo crítico na progressão do câncer) também pode ser visualizada através da tecnologia bli usando camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-Ki8,9,10. O receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 2 (Vegfr2), um tipo de receptor de VEGF, é expressado na maior parte nas pilhas endothelial vasculares de ratos adultos11. Em camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI, a seqüência de DNA de Firefly luciferase (Fluc) é derrubado no primeiro exon da seqüência Vegfr2 endógena. Como resultado, o Fluc é expresso (que aparece como sinais de BLI) de uma forma que é idêntica ao nível de angiogênese em camundongos. Para crescer além de alguns milímetros de tamanho, o tumor recruta novas vasculaturas de vasos sanguíneos existentes, que expressam altamente o Vegfr2 desencadeado por fatores de crescimento das células tumorais1. Isso abre a possibilidade de usar camundongos transgênicos Vegfr2-Fluc-KI para monitorar não invasivamente a angiogênese tumoral por BLI.
Neste protocolo, um modelo do rato do tumor-rolamento é estabelecido para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor em um único rato através da imagem latente do luciferase de Firefly (Fluc) e do luciferase de Renilla (Rluc), respectivamente (Figura 1). Uma linha de pilha 4T1 (4T1-RR) é criada que expressa estàvel Rluc e a proteína fluorescente vermelha (RFP) para traçar o crescimento da pilha por imagem latente de Rluc. Para investigar mais as mudanças dinâmicas da angiogênese na progressão e na regressão do tumor, uma outra linha celular 4T1 (4T1-RRT) é criada que expressa o vírus de herpes simplex do gene do suicídio truncado timidina kinase (HSV-TTK), rluc, e RFP. Pela administração de ganciclovir (GCV), as células de expressão de HSV-TTK são seletivamente abladas. Baseado nestas linhas de pilha, um modelo do tumor-rolamento em ratos de Vegfr2-Fluc-KI é construído que sere como um modelo experimental que ponte a progressão do tumor e a angiogênese do tumor in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Tubes</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-105-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tubes</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>601052-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4T1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Dish</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Plate</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Shanghai Lishen Scientific</td>
			<td>Hfsafe-900LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidine S Hydrochloride (BSD)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit-8</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-K0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Tegulated Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (CTZ)</td>
			<td>NanoLight Technology</td>
			<td>479474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>119222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>BIOIND</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E/U/S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganciclovir (GCV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics Software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Graphpad Prism 6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>691477H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiviral Packaging System</td>
			<td>Biosettia</td>
			<td>cDNA-pLV03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging Software</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>Living Imaging Software 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td>IVIS Lumina II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning Glass Works</td>
			<td>R21031399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SORVALL ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low Temperature Refrigerator</td>
			<td>Haier</td>
			<td>DW-86L338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>XENOGEN Corporation</td>
			<td>7293</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual bioluminescence imaging of tumor progression and angiogenesis

A angiogênese, como um processo crucial de progressão tumoral, tornou-se um ponto de pesquisa e alvo de terapia antitumoral. Entretanto, não há nenhum modelo de confiança para traçar a progressão e a angiogênese do tumor simultaneamente em uma maneira visual e sensível. A imagem latente de bioluminescence indica sua superioridade original na imagem latente viva devido a suas vantagens da sensibilidade elevada, da especificidade forte, e da medida exata. É apresentado aqui um protocolo para estabelecer um modelo do rato do tumor-rolamento injetando um renilla luciferase-etiquetou a linha de pilha do cancro da mama murino 4T1 no rato transgênicas com expressão angiogénese-induzida do luciferase do Firefly. Este modelo do rato fornece uma ferramenta valiosa para monitorar simultaneamente a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência em um único rato. Este modelo pode ser amplamente aplicado na triagem de drogas antitumorais e na pesquisa oncológica.

Neste experimento, foi estabelecido um modelo de camundongo de câncer de mama utilizando células 4T1 para investigar a relação entre o crescimento tumoral e a angiogênese tumoral (Figura 1). Primeiramente, dois Lentivirus foram empacotados, que carregaram seqüências do gene que expressam Rluc/RFP (LV-RR) e Rluc/RFP/HSV-TTK (LV-RRT), respectivamente, como relatado previamente7. Em seguida, duas linhas de células 4T1 diferentes, ...

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Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Imagem de bioluminescência dupla de progressão tumoral e angiogênese

Este protocolo descreve o estabelecimento de um modelo do rato do tumor-rolamento para monitorar a progressão e a angiogênese do tumor no tempo real pela imagem latente dupla do bioluminescência.

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

A angiogênese desempenha um papel importante na metástase e progressão tumoral. Neste protocolo, usaremos o método de imagem de bioluminescência dupla para monitorar a progressão dinâmica do tumor e a angiogênese em um modelo de camundongos de câncer de mama. Neste modelo, podemos acompanhar o crescimento do tumor e a angiogênese simultaneamente no camundongo único através da luciferase Firefly e da imagem luciferase de Renilla, respectivamente.Este modelo pode ser amplamente aplicado em pesquisa de antitumor drug e oncologia. Este modelo de bioluminescência dupla pode ser usado para rastrear a progressão e a regressão do tumor e para detectar processos moleculares relacionados ao tumor em resposta a estratégias terapêuticas. Angiogênese é um processo crucial de progressão do tumor.Portanto, o monitoramento da progressão do tumor e da angiogênese de forma visual e sensível é necessário para o desenvolvimento de tratamentos tumorais eficazes. Os procedimentos serão demonstrados por Kaiyue Zhang, Chen Wang e Shang Chen, estudantes do nosso laboratório. Para embalagem de lentivírus e sementes de produção uma vez 10 a 10 a o sexto de células 293T em dois mililitros de DMEM suplementados com soro bovino 10% fetal por poço em uma placa de seis poços para cultura noturna em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Na manhã seguinte misture 7,5 microliters de liposesom com 250 microliters de Minimal Essential Medium em dois tubos separados de 1,5 mililitro para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. Para preparar as soluções de DNA adicione o vetor plasmídeo lentivírus RR e plasmídeos auxiliares a 250 microliters de Minimal Essential Medium em tubos individuais de 1,5 mililitros conforme descrito na tabela. No final da incubação adicione suavemente as soluções de DNA RR às suspensões lipossóias de forma em termos de gota e permita que o DNA se conecte às membranas lipídicas por 20 minutos à temperatura ambiente.Enquanto a mistura está incubando, substitua o supernascedor da cultura celular 293T por um mililitro de cultura fresca, e adicione suavemente 0,5 mililitros da mistura de DNA lipossome apropriada a cada poço. Devolva as células à incubadora de cultura celular por 12 a 16 horas antes de substituir o supernacido em cada poço por um mililitro de cultura fresca complementada com antibióticos. Após mais 36 horas de incubação, acumule os supernacantes em um tubo cônico por cepa de lentivírus para sedimentar as células 293T por centrifugação.Em seguida, transfira os supernantes contendo RR de lentivírus em tubos de armazenamento de polipropileno estéril de 1,5 mililitro para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para transdução lentiviral para expressão genética em células tumorais mamárias 4T1, substitua o supernante em cada poço de uma placa de cultura celular 4T1 de seis poços por um mililitro de cultura celular fresca baseada em RPMI complementada com soro bovino fetal e um mililitro de estoque lentiviral. Em seguida, adicione oito microgramas por mililitro de Polybrene a cada poço, e delicadamente pipeta algumas vezes para misturar.Centrifugar a placa para ajudar a aumentar a eficiência da transdução, e devolver as células à incubadora de cultura celular por quatro a 12 horas. No final da incubação, substitua o supernascer em cada poço por meio de cultura fresca suplementado com soro e antibióticos para remover quaisquer partículas lentivirais e Polybrene. Para selecionar para as células transduzidas pelo lentivírus, transde as culturas celulares 4T1 transduzidas em uma proporção de um para três para um para quatro com o meio de seleção, alterando o meio a cada dois ou três dias.Após sete dias de seleção de cultura média, veja as culturas celulares transduzidas sob um microscópio de contraste de fase invertida de fluorescência e conte o número de células fluorescentes fluorescentes vermelhas ou RFP-4T1 e todas as células 4T1 em três campos de visão para estimar a razão RFP-positivo. Para configurar um modelo de camundongo portador de tumor, lave 80% de culturas celulares transduzidas com PBS antes de destacar as células com dois mililitros de trippsina-EDTA por placa de cultura de 60 milímetros. Quando as células tiverem levantado dos fundos da placa, pare a reação com cinco a 10 mililitros de soro suplementado médio por placa.E transfira as culturas para tubos de centrífugas individuais de 15 mililitros para contar. Diluir as células para uma única vezes 10 a sexta células por 100 microliters de meio de cultura sem concentração de soro. E injete subcutâneamente 100 microlitadores da linha celular 4T1-RR no ombro esquerdo de um rato modelo de tumor anestesiado, e 100 microliters da linha de células 4T1-RRT no ombro direito do mesmo mouse.Após as injeções, coloque cada rato em uma área de recuperação apropriada com um suporte térmico até que esteja totalmente recuperado. Palpar as massas tumorais todos os dias durante sete dias para confirmar que os camundongos são portadores de tumores. No sétimo dia pós-implantação, injete intraperitoneally 50 microgramas por quilograma de Ganciclovir em cada rato portador de tumor duas vezes por dia até o final do experimento.Para o crescimento do tumor, abra o Sistema de Imagem Viva. Inicialize o software Living Imaging e inicialize o sistema. Enquanto o sistema está inicializando, use uma seringa de insulina para injetar cada rato para ser imageado com o volume apropriado de coelenterazina na barra retrobulina.Coloque os ratos injetados na câmara da câmera e obtenha imediatamente várias fotos do rato dorsalmente para adquirir os sinais de luciferase renilla de células 4T1 até que os sinais bioluminescentes desapareçam. 10 minutos após a imagem da luciferase renilla, use uma seringa de insulina para injetar intraperitonealmente o volume apropriado de D-luciferina em cada animal. 10 minutos após a injeção de D-luciferin, coloque os ratos na câmara da câmera e obtenha várias imagens do rato dorsal para adquirir os sinais de luciferase firefly da angiogênese.Após a transdução de lentivírus, mais de 99% das células são RFP-positivos, sem diferenças na morfologia da cultura celular observada entre as duas linhas celulares transduzidas. Posteriormente, a imagem de bioluminescência das células transduzidas revela que ambas as linhas celulares emitem fortes sinais bioluminescentes de uma força semelhante. Após a injeção subcutânea das linhas celulares transduzidas em um modelo de camundongos com tumor transgênico, o crescimento do tumor induzido pela angiogênese pode ser avaliado por sinais de luciferase firefly na presença de D-luciferina no mesmo animal.Aos sete dias após a implantação, a administração ganciclovir induz a morte nas células 4T1-RRT, resultando em uma redução dramática do sinal de luciferase renilla nos tumores estabelecidos por essas células. Os sinais de luciferase de vagalume também aumentam em conjunto com o aumento da expressão da luciferase renilla e diminuem após o declínio da luciferase. Juntos, esses resultados sugerem que há uma correlação direta entre angiogênese tumoral e crescimento tumoral.De fato, a morte celular tumoral induzida por Ganciclovir pode levar a uma inibição da angiogênese tumoral. Além disso, a imunosmunagem para o receptor de fator de crescimento endotelial anti-vascular II, como um marcador de angiogênese, revela uma estrutura microvascular mais significativamente estabelecida em seções de tecido tumoral 4T1-RR do que em seções de tumores 4T1-RRT, consistente com o declínio do sinal de luciferase firefly observado após a administração de Ganciclovir. A etapa mais crítica do protocolo é usar dois tipos de luciferase, como FLuc e RLuc para rastreamento simultâneo das células e da angiogênese.Essa tecnologia pode ser usada para tratar células cancerígenas em diferentes locais, e pode ser amplamente usada em modelos de câncer de vírus. Este modelo de camundongos permite que o crescimento do tumor e os efeitos anti-tumores do sistema de rastreamento HSV-ttk/GCV sejam visualizados dinamicamente em um animal vivo. Uma instalação de nível II de biossegurança é necessária para evitar uma transfecção de lentivírus, já que a mídia contém partículas de lentivírus que podem ser prejudiciais aos seres humanos.

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Modelos MAME para formação de imagens 4D Live-célula do tumor: Interações microambiente que a progressão de Impacto maligno

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Criação de um Modelo de Xenoenxerto Humano mieloma múltiplo na galinha para estudar o crescimento tumoral, invasão e angiogênese

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...